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染色检查法是应用不同染色技术使细菌着色，再用显微镜观察。细菌着色后，细菌的可视性增加，因此在细菌的鉴别上较不染色法有更广泛的应用。细菌常用的染色法有单染色法、复染色法、特殊结构染色法以及荧光染色法等。标本染色后通过对细菌的形态、大小、排列、结构和染色特性的观察，不仅可验证培养物是否为纯种，而且是细菌分类和鉴定不可缺少的组成部分。此外，对细菌鞭毛、芽孢等特殊结构进行染色检查，对于鉴定细菌亦有重要的作用。

（二）目的要求

（1）掌握细菌涂片制作的方法。

（2）掌握革兰染色的原理、方法、结果判定及意义。

（3）熟悉抗酸染色法的原理和方法。

（4）了解细菌的鞭毛、芽孢和荚膜等特殊结构染色的方法。

（三）器材与试剂

1.菌种　金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、结核分枝杆菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌L型、白喉棒状杆菌。

2.试剂　革兰染液、抗酸染液、细胞壁染液、芽孢染液、鞭毛染液、荚膜染液、异染颗粒染液、金胺O染液、吖啶橙染液、生理盐水等。

3.其他　普通光学显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、蜡笔、擦镜纸、吸水纸、脱油剂等。

（四）步骤与方法

1）原理　革兰染色的原理目前有以下三种学说：①通透性学说：革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层较厚，含脂质少，脱色时，乙醇不易进入，而且95%乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小，通透性降低，阻碍结晶紫和碘复合物渗出。而革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层较薄，含脂质多，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增强，细胞内的结晶紫与碘复合物易被溶出而脱色。②等电点学说：革兰阳性菌的等电点（pI 2～3）比革兰阴性菌（pI 4～5）低，在同一pH条件下，革兰阳性菌带负电荷比革兰阴性菌要多，与带正电荷的碱性染料（结晶紫）结合牢固，不易脱色。③化学学说：革兰阳性菌含有大量的核糖核酸镁盐，与进入胞质内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95%乙醇脱色；而革兰阴性菌含此种物质少，故易被乙醇脱色。

（1）细菌标本片的制备：

①涂片：取清洁无油迹的载玻片1张，用蜡笔画线将其分成左右两格。用接种环先挑取生理盐水1～2环于载玻片每格中央，再分别挑取大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌少许菌落与生理盐水轻轻研匀，涂成直径约1.5 cm的菌膜。

②干燥：让涂片自然干燥，也可在酒精灯火焰较远处微微加热烘干，但切勿靠近火焰。

③固定：干燥后的标本片在酒精灯外焰上以钟摆速度来回通过3次，冷却后染色。

固定的目的在于杀死细菌，并使菌膜与载玻片牢固黏附，避免染色过程中被水冲洗掉；通过固定还可凝固菌体蛋白，改变细菌对染料的通透性，有利于染料进入细胞内，使细菌易与染料结合而着色；还可以尽可能地保持细菌原有的形态和结构。

①初染：在载玻片的菌膜上滴加结晶紫染液1～2滴，室温染色1 min后，用细流水从载玻片的一端将未与细菌结合的染料冲洗掉。

②媒染：然后滴加卢戈碘液，室温染色1 min后，流水冲洗。

③脱色：再滴加95%乙醇，轻轻左右晃动载玻片，可补充脱色液，直至无紫色液体流出为止，时间约30 s，流水冲洗。

④复染：最后滴加稀释复红（或沙黄）染液室温染色1 min后，流水冲洗。烘干（或用吸水纸吸干）载玻片水分。

（3）显微镜观察：用低倍镜找到视野后，滴加香柏油，转换油镜，观察细菌的颜色、形态、大小及排列方式。

3）结果　革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌染成红色。

2.萋-尼抗酸染色法

1）原理　抗酸菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以抗酸菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝菌酸与染料一旦结合，就很难被酸性脱色剂脱色，故抗酸菌能保持复红的颜色。而非抗酸菌染色后容易被盐酸-乙醇溶液脱色，最后被复染成蓝色。

（1）制片：同革兰染色法。

（2）初染：在载玻片的菌膜上滴加苯酚复红染液1～2滴，慢慢加热至有蒸汽冒出，切不可沸腾，并随时添加染液，染色3～5 min，冷却后水洗。

（3）脱色：再滴加3%盐酸-乙醇溶液，轻轻左右晃动载玻片，并补充3%盐酸-乙醇溶液，直至流过菌膜的盐酸-乙醇溶液无红色流出，流水冲洗。

（4）复染：最后滴加吕氏美蓝染液室温染色0.5～1 min，流水冲洗。干后镜检。

3）结果　抗酸菌呈红色，非抗酸菌呈蓝色。

3.细胞壁染色法

1）原理　组成细菌细胞壁的主要化学成分是肽聚糖，它与染料结合的能力差，不易着色，在细菌的染色过程中，一般情况下染料都是通过细胞壁的渗透、扩散等作用而进入细胞，细胞壁本身并未染色。鞣酸和磷钼酸均可起媒染作用，使细胞壁形成可着色的复合物，而细胞质不易被染色，媒染剂处理后用结晶紫等染料染色，便可在普通光学显微镜下观察到细胞壁。细菌L型为细胞壁缺陷型，可通过细胞壁染色来鉴别。

（1）涂片、干燥：同革兰染色法。

（2）滴加100 g/L鞣酸固定标本15 min，水洗。

（3）滴加5 g/L结晶紫染液染色3～5 min，水洗，干后镜检。

3）结果　有细胞壁的细菌仅菌体周边染成紫色，菌体内部无色；无细胞壁的细菌（如细菌L型）整个菌体都染成紫色。

4.芽孢染色法（苯酚复红法）

1）原理　细菌芽孢壁较厚，着色较困难，而一旦着色又难以脱色。可通过加热促进染料进入芽孢和菌体，然后用乙醇使进入菌体的染料脱色，菌体被染成复染剂的颜色；但乙醇不能脱去进入芽孢的染料，用复染剂染色后芽孢仍然保留初染剂的颜色，于是菌体和芽孢分别呈现不同颜色，易于区分。

（1）制片：同革兰染色法。

（2）初染：在菌膜上加苯酚复红染液，用微火加热使染液冒蒸汽5 min，注意不能煮沸或烧干，加热过程中应随时添加染液，冷却后水洗。

（3）脱色：用95%乙醇脱色1～2 min，水洗。

（4）复染：用碱性美蓝染色1 min，水洗，干后镜检。

3）结果　菌体呈蓝色，芽孢呈红色。

1）原理　鞭毛形态细长且十分脆弱，需在电镜下才能观察到，若用特殊染料使鞭毛增粗并着色，则在普通光学显微镜下也能观察到。鞭毛染色的方法很多，但基本原理相似，即采用不稳定的胶体溶液作为媒染剂，并使其沉淀于细菌鞭毛上而使鞭毛加粗，再进行染色后可在油镜下观察。根据染色剂的不同，分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法、镀银染色法和荧光蛋白染色法等。

（1）改良Ryu法：

①鞭毛染色可从平板上直接挑取菌落，也可从斜面培养基上刮取菌苔涂片，必须注意动作尽量轻，以免鞭毛脱落。培养基应为营养较好的琼脂平板（如血琼脂平板、营养琼脂平板等），不可用含抑制剂的选择培养基（如SS、中国蓝、MAC培养基等）。

②要求用新的载玻片，用前在95%乙醇中浸泡24 h以上，用时从乙醇中取出，用干净的纱布擦干使用。若水滴向周围流散而不形成水珠表示载玻片处理良好。

③在载玻片上加蒸馏水1滴，用接种针蘸取菌落少许，将细菌点在蒸馏水滴的顶部（一般只需点一下，仅允许极少量细菌进入水滴），使其自然流散成薄膜，不可搅动，以免鞭毛脱落。

④室温自然干燥，不可在火焰上烘干。

⑤滴加Ryu染液，染色10～15 min后，将载玻片微倾斜，将蒸馏水缓慢滴加在载玻片顶端无菌膜处洗去染液，注意洗净染液表面的金属光泽液膜。

⑥载玻片自然干燥后镜检。观察时应从细菌较少的地方寻找鞭毛。

（2）鞭毛镀银染色法：

②在制好的菌膜上滴加甲液（鞣酸染液）染3～5 min，蒸馏水洗。

③用乙液（氨银染液）冲去残留蒸馏水，加乙液，并在火焰上方稍加热0.5～1 min，待有蒸汽冒起时用蒸馏水冲洗，干后镜检。

3）结果　改良Ryu法菌体呈红色，鞭毛呈淡红色；鞭毛镀银染色法菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。

1）原理　荚膜是细菌体外的一层黏液性多糖物质，与染料的亲和力弱，不易着色。通常采用负染色法，即使菌体和背景着色而荚膜不着色的染色方法，荚膜在菌体周围呈一透明圈。Hiss硫酸铜染色法是用结晶紫初染，使荚膜和菌体均被染成紫色，由于荚膜与结晶紫结合不牢，经硫酸铜冲洗时荚膜被洗脱去结晶紫而与硫酸铜结合，故荚膜被染成蓝色。墨汁负染色法则采用墨汁，因墨汁带负电荷，故菌体不着色，只能使背景着色。实际工作中还可用墨汁负染色法配合单染色法（如美蓝）检查细菌的荚膜，镜下可见黑色背景中，蓝色菌体周围包绕一层无色透明的荚膜。

（1）Hiss硫酸铜染色法：

①涂片，自然干燥，加热固定。

②滴加1%结晶紫染液，在火焰上微微加热至染液冒蒸汽为止。

③用20%硫酸铜溶液将载玻片上的染液洗去（注：切勿水洗），自然干燥后镜检。

（2）墨汁负染色法：

①加1滴墨汁于洁净的载玻片上，取少量细菌与其充分混匀。

②用镊子夹一张盖玻片，倾斜盖玻片使其一边接触菌液边缘，菌液沿着盖玻片边缘扩散，然后缓慢放下盖玻片。

3）结果　Hiss硫酸铜染色法菌体及背景均呈紫色，荚膜呈淡紫色或无色；墨汁负染色法背景呈灰色，菌体较暗，荚膜在菌体周围呈一明亮的透明圈。

7.Albert异染颗粒染色法

1）原理　该法常用于白喉棒状杆菌异染颗粒的染色，白喉棒状杆菌异染颗粒主要成分是核糖核酸和多磷酸盐，经染色后与菌体着染颜色不同，故称为异染颗粒。

（1）细菌经涂片、干燥，火焰固定。

（2）滴加甲苯胺蓝染液（甲液）染色3～5 min，水洗。

（3）滴加Albert碘液（乙液）染色1 min，水洗，干后镜检。

3）结果　菌体呈蓝绿色，异染颗粒呈蓝黑色。

1）原理　荧光染色一般采用能够发荧光的物质对标本进行染色，在荧光显微镜下观察发荧光的细菌。常用的荧光染料有金胺O、吖啶橙等。金胺O染色法临床上主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等抗酸菌的检测，染色原理与萋-尼抗酸染色法相似。吖啶橙染色法则是利用该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，与细菌或真菌的DNA结合后发绿色荧光，与细菌或真菌的RNA结合后发橙色荧光。

（1）金胺O染色法：

①制片：涂片，自然干燥，甲醇固定1～2 min或加热固定。

②初染：在玻片菌膜上滴加金胺O荧光染液，室温避光染色10～15 min，流水冲洗。

③脱色：滴加3%盐酸-乙醇溶液脱色3～5 min，轻轻左右晃动载玻片，并补充盐酸-乙醇溶液，直至流过菌膜的盐酸-乙醇溶液无黄色，流水冲洗。

④复染：最后滴加0.5%高锰酸钾溶液室温染色2～3 min，流水冲洗。干后荧光显微镜镜检。

（2）吖啶橙染色法：

①涂片，自然干燥，甲醇固定1～2 min。

②滴加吖啶橙染液，避光染色2 min，流水冲洗，干后荧光显微镜镜检。

3）结果　金胺O染色法抗酸菌呈亮黄色或橘黄色荧光，非抗酸菌、细胞、背景呈暗黄色；吖啶橙染色法菌体细胞核的DNA呈黄色或黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的RNA呈橘黄或橘红荧光。

（五）注意事项

（1）制片时涂片厚薄要适宜，以菌膜刚好能透过字迹为宜（半透明）。在火焰上固定时要掌握火候，既要杀死细菌，又不能破坏细菌原有形态。

（2）革兰染色脱色时间长短要适宜，如果涂层较厚，应相应延长脱色时间，如涂层较薄，则相应缩短脱色时间，脱色时应不断旋转载玻片摇匀，使其充分均匀脱色，通常脱到乙醇中没有紫色流下即可。

（3）抗酸染色中若未见到染成红色的菌体，可能是标本中结核分枝杆菌过少，制片过程中未取到菌；也可能是在初染过程中时间短或加热不得当，而使结核分枝杆菌未着色。

（4）在芽孢染色中，初染加热至产生蒸汽，不可煮沸，不可干涸，否则芽孢着色效果不好。

（5）在鞭毛染色中，载玻片一定要洁净无油污，以免影响菌体形态；涂片时要尽量使细菌自由分散于蒸馏水中，切勿搅动和研磨，以免鞭毛脱落；菌膜要自然干燥，以免破坏鞭毛的形态。

（6）在荚膜染色过程中，一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。

（7）金胺O、吖啶橙荧光易衰减，尽量避光操作。

（1）革兰染色的原理是什么？哪些因素会影响革兰染色的结果？