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1.器材　恒温培养箱、二氧化碳培养箱、磨口玻璃干燥器、厌氧袋、厌氧罐、真空泵、厌氧培养箱等。

2.试剂　各种培养基、碳酸氢钠、浓盐酸、钯粒、美蓝（亚甲蓝）等。

3.气体　N2、CO2、H2。

（三）步骤和方法

1.细菌培养方法　根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同环境条件（气体、温度等）进行培养。常用的有需氧培养法、CO2培养法、微需氧培养法和厌氧培养法。为了提高临床标本病原菌的检出率，同一标本常同时采用两种或三种不同的方法培养。

1）需氧培养法　本法是细菌检验室最常用的常规培养方法，是指需氧菌或兼性厌氧菌在普通大气环境下的培养方法，又称为普通培养法。将已接种好的各种培养基置于35～37℃恒温培养箱内培养18～24 h，多数细菌可见生长现象；但少数生长缓慢的细菌，需培养3～7天，甚至1个月才能出现生长现象。因此培养生长缓慢的细菌时，为了防止培养基干裂，应接种于试管培养基，并用无菌液体石蜡或凡士林封住试管外口塞接合处。另外，要根据细菌种类不同及用途，调整适当的培养温度。如鼠疫耶尔森菌的最适生长温度为25～28℃，李斯特菌在4℃也能生长，铜绿假单胞菌在42℃仍可生长，可用于鉴定这些细菌。注意一般在培养箱内置一杯蒸馏水，使培养箱内保持一定湿度，有利于细菌生长繁殖。

2）CO2培养法　有些细菌（如脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、嗜血杆菌等）初次分离培养时需提供5%～10%CO2气体环境才能生长，可采用下列方法供给一定浓度的CO2。

（1）CO2培养箱法：是目前细菌检验室最常用的方法，通过CO2培养箱自动调节CO2气瓶中CO2进入培养箱的量，并能自动控制湿度和温度，设定好CO2浓度和温度即可使用，培养物置于培养箱中，即可获得CO2培养环境（见图1-13及文后彩图）。

（2）烛缸法：将已接种好细菌的培养基放入容量为2000 mL的磨口标本缸或干燥器内，为了隔绝空气，在缸盖口及缸口涂上凡士林，在缸内放置一段点燃的蜡烛，应稍高于培养物，不可靠近缸壁，加盖密闭，再用凡士林彻底密封外缘盖口（图1-14）。缸内燃烛于0.5～1 min后因缺氧自行熄灭，此时缸内CO2含量为5%～10%，将烛缸置于35～37℃恒温箱中培养。

（3）化学法：常用碳酸氢钠-盐酸法。按每升容积加入碳酸氢钠0.4 g和浓盐酸0.35 mL的比例，分别将两种试剂置于同一器皿内（如平皿），但不能使二者混合，连同已接种好标本的培养基一起置于磨口玻璃缸或干燥器内，同样缸盖口和缸口涂上凡士林，盖紧缸盖后倾斜容器，使浓盐酸与碳酸氢钠接触，生成CO2以满足某些细菌培养所需（图1-14）。将玻璃缸置于35～37℃恒温箱培养箱中培养。

（4）气袋法：选用无毒透明的塑料培养袋，将接种好标本的平板放入袋内，尽量去除袋内空气后将袋口密封。折断袋内已置的CO2产气管使其产生CO2，数分钟内即可获得需要的CO2培养环境。将气袋置于35～37℃恒温培养箱培养。

3）微需氧培养法　微需氧菌（如弯曲菌、幽门螺杆菌）在大气中及绝对无氧环境中均不能生长，在含有5%O2、10%CO2和85%N2的气体环境中才可生长，将标本接种到培养基上，置于上述气体环境中，35～37℃进行培养即为微需氧培养法（有气罐法和气袋法）。

4）厌氧培养法　培养厌氧菌时，须除去培养环境或培养基中的O2，或使用还原氧化型物质，以降低其氧化还原电势，厌氧菌才能生长。常用的厌氧培养法有以下几种。

（1）庖肉培养基法：庖肉培养基中的肉渣含有不饱和脂肪酸及硫基等还原性物质，能吸收培养基中的O2和使氧化还原电势下降，同时在液面覆盖一层无菌凡士林或液体石蜡，以隔离空气中的O2继续进入培养基，形成良好的厌氧条件，并可借凡士林上移与否，指示该菌是否产气。方法是将庖肉培养基在水浴液中煮沸10 min，冷却，接种厌氧菌于庖肉培养基内。于培养基液面上加灭菌的液体石蜡或溶化的凡士林1～2 mL隔绝空气。37℃培养24～48 h，观察厌氧菌生长情况。观察细菌产气时应该用凡士林进行封盖。

（2）厌氧袋法：厌氧袋是一种特制不透气的塑料袋（见图1-15及文后彩图），袋中放有气体发生小管、催化剂小管（内放钯粒）和厌氧环境指示剂（美蓝）。将接种好的平板放入袋中，排出袋中气体，卷叠好袋口，用弹簧夹夹紧，然后折断气体发生小管中安瓿，使发生反应产生CO2和H2等。在催化剂钯粒的作用下，H2与袋中剩余O2反应生成H2O，使袋内环境达到无氧。约半小时后，再折断含美蓝液安瓿管（美蓝在无氧环境中无色，在有氧环境中变成蓝色），如指示剂不变蓝，表示袋内已成无氧环境，此时即可放于35～37℃恒温箱培养24～48 h后，观察厌氧菌生长情况。

（3）厌氧盒法：用透明硬塑料制成密闭的厌氧培养盒（见图1-16及文后彩图），原理和方法同厌氧袋法。

（4）厌氧罐法：将接种标本的琼脂平板或试管置于带有活塞的密封缸内（见图1-17及文后彩图）。缸内同时放有冷触媒钯粒10～20粒、已煮沸去氧的美蓝指示剂1管。用真空泵通过活塞抽去缸内的空气，充入N2，反复2～3次，再充入85%N2、10%CO2和5%H2的混合气体。置密封缸于37℃培养24～48 h后，观察厌氧菌生长情况。

（5）厌氧培养箱法：将厌氧培养的平板或试管置于厌氧培养箱内进行培养的方法。厌氧培养箱主要是利用密封、抽气、换气或化学等方法去除氧以形成厌氧环境，以利于厌氧菌的生长繁殖。厌氧培养箱首先必须外接含厌氧气体的气瓶，装有真空表、真空泵气阀、温度控制器、总电源指示灯、培养罐气阀。箱内装有远红外线加热器、需氧培养槽以及整个培养罐体。

（6）厌氧手套箱法：此法分离厌氧菌效果最佳。用透明硬塑料制成密闭的厌氧手套箱，外接厌氧气瓶，箱内用抽气换气法保持厌氧状态。整个培养过程包括培养基制作、标本接种、培养、观察结果等，均通过箱上安装的橡皮手套在箱内操作和处理，使培养物始终处于无氧环境中，不与空气接触（见图1-18及文后彩图）。

2.细菌生长现象的观察　根据培养基物理性状的不同，细菌在固体培养基、半固体培养基和液体培养基上的生长现象也不同。

1）固体培养基　细菌在固体培养基上生长的是菌落和菌苔，主要通过观察菌落特征来初步鉴别细菌。将标本或培养物划线接种于固体培养基表面，经适宜环境培养后，单个细菌分裂繁殖，形成一个肉眼可见的细菌集团，称为菌落（colony）。多个菌落堆积或连在一起形成线状或片状的更大细菌集团，称为菌苔（lawn）。不同细菌形成的菌落特征也不尽相同，表现在菌落形态、大小、溶血性、产生色素和气味等方面，依此可以初步鉴别细菌。

（1）菌落形态：包括菌落形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等）、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、波形、锯齿状、卷发状等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和黏度等。根据菌落表面特征不同，可将菌落分为3型：①光滑型菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、湿润、半透明，边缘整齐，新分离的细菌大多呈S型菌落。②粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、不透明，呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐，R型菌落多为S型细菌变异失去菌体表面多糖或蛋白质后形成，也有少数新分离的细菌毒力株就是R型，如炭疽芽孢杆菌、结核分枝杆菌等。③黏液型菌落（M型菌落）：菌落黏稠、有光泽、透明似水珠样，多见于有厚荚膜或丰富黏液层的细菌。

（2）菌落大小：不同细菌在相同培养基、相同环境和相同的培养时间，其菌落大小各有差异。通常细菌的菌落有大菌落（菌落直径＞2 mm）、中等菌落（菌落直径1～2 mm）、小菌落（菌落直径0.5～1 mm）或针尖样菌落（菌落直径＜0.5 mm）。

（3）菌落溶血性：在绵羊血或兔血琼脂平板上，细菌可以产生不同的溶血反应，一般分为α、β、γ溶血。①α溶血：又称草绿色溶血、甲型溶血或不完全溶血，菌落周围出现草绿色溶血环（宽1～2 mm），镜下可见残存的红细胞（如甲型链球菌、肺炎链球菌），注意有的细菌放置于冰箱才能出现草绿色溶血环。②β溶血：又称完全溶血、乙型溶血或透明溶血，菌落周围有宽2～4 mm、界限分明、完全透明的溶血环，镜下观察红细胞完全被溶解（如金黄色葡萄球菌）。③γ溶血：用肉眼观察不到溶血现象，即不溶血。

注意溶血不仅仅发生在菌落周围，也可能出现在菌落下面，可用以下三种方法观察溶血特征。①将平板置于光源前面，让光源透过平板观察。②用接种环或无菌棉签移去菌落，观察长菌区域的溶血情况。③用显微镜观察溶血性。一般而言，在厌氧状态下细菌产生溶血较好，因此，常规工作中，接种时可将标本或细菌用接种针穿刺接种于血琼脂培养基内2～3 mm处，使细菌接种到培养基深处，35～37℃培养过夜，可以清晰地观察溶血情况。

（4）产生色素：有些细菌可产生色素，使菌落或培养基出现颜色，色素可分为脂溶性色素和水溶性色素两种，水溶性色素可使菌落及其周围培养基出现颜色（如铜绿假单胞菌），脂溶性色素只在菌落中有颜色（如金黄色葡萄球菌等）。颜色有红色、白色、灰白色、黑色、绿色、黄色、金黄色、橙色、柠檬色、棕色、紫色等。不同细菌可产生不同的色素，大多数产色素的细菌只产生单一色素，少数细菌（如铜绿假单胞菌）可产生多种色素。有些细菌（如金黄色葡萄球菌、铅黄肠球菌等）的色素产生很稳定，有些细菌（如黏质沙雷菌）的色素产生很不稳定。

（5）气味：某些细菌在培养基中生长繁殖后可产生特殊气味，如芳香产碱杆菌（浓烈的水果香味）、嗜血杆菌（“鼠穴”味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、某些芽孢杆菌（腐叶气味）等，另外个人嗅觉有差异，不能完全靠闻。

2）半固体培养基　主要用于细菌动力实验，观察穿刺线是否清晰可见以及周围培养基混浊程度及运动轨迹。有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺线两侧也可见羽毛状或云雾状混浊生长，为动力实验阳性。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿刺线周围的培养基仍然澄清透明，为动力实验阴性（图1-19）。

3）液体培养基　细菌在液体培养基中有均匀混浊式、菌膜式、沉淀式3种生长现象。大多数兼性厌氧菌（如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌）在液体培养基生长繁殖后呈均匀混浊式生长；专性需氧菌（如铜绿假单胞菌、结核分枝杆菌和诺卡菌等）一般呈表面生长，常形成菌膜，菌膜厚度不一；厌氧菌和链球菌多为沉淀式生长，培养基底部出现絮状沉淀物（图1-20）。

图1-20　液体培养基生长现象（依次为透明、均匀混浊、沉淀、菌膜）