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2.培养基　液体培养基（营养肉汤）、半固体培养基、固体斜面培养基（营养琼脂斜面、克氏双糖铁琼脂斜面）、固体琼脂平板（营养琼脂、血琼脂、MAC琼脂、伊红美蓝（EMB）琼脂平板）。

3.器材　接种环、接种针、无菌L形棒、酒精灯、1 mL刻度吸管和吸耳球等。

（三）步骤与方法

（1）接种针和接种环：由绝缘柄、金属柄、螺口和接种丝组成（图1-3）。其中接种丝应具备硬度适宜、易传热、散热、不易生锈、经久耐用等性能，白金丝是最佳选择，但因其昂贵，通常用300～500 W电热（镍）丝代替。将接种丝末端圈成内径为2～4 mm环状时则为接种环，若拉直呈长度为5～8 cm针状时为接种针。螺口用来安装固定接种丝。使用时手执绝缘柄。接种环（针）在使用前后必须用酒精灯或无明火的红外线灭菌器灼烧灭菌，未取菌的接种环（针）直接在酒精灯外焰灼烧灭菌，取过菌的先在内焰灼烧，后转入外焰灼烧灭菌。接种针主要用于穿刺接种法；接种环主要用于液体和固体培养基接种等，也可用标准接种环制备一定浓度的菌悬液或定量接种活菌计数。

（2）L形玻璃棒：将直径为2～3 mm的玻璃棒一端弯成L形即成。L形玻璃棒在使用前必须灭菌，可用纸包扎高压蒸汽灭菌或临用前蘸取酒精在酒精灯外焰灼烧灭菌。L形玻璃棒主要用于涂布接种法。

2.接种环境　为了防止接种过程中标本中的细菌污染环境、感染工作人员以及环境中的细菌污染培养基，特别是传染性较强的病原菌，应在无菌环境内接种，目前常用的无菌环境有生物安全柜、超净工作台或无菌室等。

3.无菌操作技术　指防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术。细菌的接种及分离要切实执行无菌操作技术。

（1）临床细菌学检验的每一项技术操作，均应在无菌环境下进行，即在无菌室、生物安全柜、安全罩或超净工作台内进行，或在酒精灯或煤气灯火焰旁进行。注意在生物安全柜内操作不能有明火存在，需用红外线灭菌器来灼烧灭菌接种环或接种针。

（2）从培养试管中取培养物或移种于另一培养管时，在拔出试管塞或合上试管塞前，均应将试管口塞交界处在酒精灯外焰上通过2～3次，以杀灭可能污染的或从空气中落入管口的污染菌。在开启试管塞时，应用无名指、小指和手掌夹住塞子，不得任意放置；操作时应保持试管口接近火焰；完毕后将试管口及塞子在酒精灯外焰上通过2～3次后，将塞子塞回试管口。

（3）操作过程中，若不慎发生无菌吸管、滴管下部触及未消毒的手或物品时，应弃去，不得使用。

4.接种及分离方法　一般根据待检标本性质、培养目的及所用培养基的种类，选用不同的接种分离方法，具体包括平板划线分离法、穿刺接种法、斜面接种法、液体接种法、涂布接种法、倾注平板法、自动接种法。

1）平板划线分离法　该法是细菌分离培养的基本技术，通过平板划线分离，可使标本中混合或混杂的细菌沿划线在平板表面分离，得到分散的单个菌落，以便于观察细菌菌落形态及特征，同时获得纯的菌种，以便进一步鉴定。

平板划线分离法的前提是能够正确手持平板、无菌操作和平稳划线，具体操作为：右手持接种环先烧灼灭菌，待冷却后挑取标本或培养菌；左手手心向下持平板，平板底置于掌心，五指控制平板盖边缘，接种时向外翻转手掌，平板应置于酒精灯前上方（通常指酒精灯外焰直径10 cm范围内为无菌区），用拇指内侧、小指和无名指固定平板底，用拇指、食指和中指将平板盖稍微提高，并使平板盖与桌面平行，平板底与桌面成30°～45°角，方可应用各种划线分离法开始划线，划线时平板开口接近火焰，划完立即合上平板，并标示接种标本号、日期和接种者，倒置于恒温箱培养后观察结果。

平板划线分离法常用的有连续划线分离法、分区划线分离法和棋盘划线分离法。

（1）连续划线分离法：用于接种含菌量较少的标本或纯培养菌。接种时用灭菌接种环挑取接种物，直接伸入平板底部，轻轻密集划线平板的1/5区域，随后做大幅度的Z字形（似蛇形）连续划线，直至划完整个平板（图1-4）。

（2）分区划线分离法：该法用于接种含菌量较多的标本（如粪便、脓液、痰液等或混合细菌）的分离培养。其方法是将一个平板分成3～5个区域，用灭菌接种环挑取标本后，先在1区密集连续划线，再在2、3、4、5区域依次划线。每划完一个区域，应将接种环灼烧一次，冷却后再划下一区域。每一区域的划线仅接触上一区域的划线交接处3～5次，使菌量逐渐减少，以便获取单个菌落（图1-5）。（3）棋盘划线分离法：该法主要用于含菌量较多的标本，但由于操作复杂，较少用。将用灭菌接种环挑取的标本先密集划线于平板上1/5处，随后平行划线6～8条，灭菌接种环，冷却后，再做垂直划线6～8条，使之成正方格。同法再交叉划两排斜线，似呈棋盘形（图1-6）。2）穿刺接种法　该法主要用于半固体培养基的接种，适用于保存菌种、厌氧培养和观察细菌的动力等。方法是用接种针挑取少许细菌，垂直刺入培养基的中心直达试管底部，但不能完全刺到管底，距离管底至少0.5 cm（一般刺入培养基高度的1/2～2/3即可），再沿穿刺线原路退出（图1-7）。

3）斜面接种法　因有两种不同用途的斜面培养基，所以接种方法有所不同。一种是用于菌株的移种，以获取纯种进行鉴定和保存菌种，也可用于菌种的传代，常用（血）营养琼脂斜面培养基，方法是用接种环挑取单个菌落，自斜面底端向上划一条直线，然后直接返回底部向上做Z字形（似蛇形）连续划线接种（图1-8）；另一种是用于生化鉴定的斜面培养基，如克氏双糖铁、三糖铁等斜面培养基，方法是用接种针挑取少许细菌，先以穿刺法刺入培养基，再直接返到斜面底端向上做Z字形（似蛇形）连续划线接种（图1-9）。

4）液体接种法　该法主要用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体培养基的接种。方法是接种时将试管倾斜30°～45°角，用接种环挑取标本或培养物在试管内壁与倾斜下液面交接处反复研磨，使细菌混合液扩散于培养基中，试管直立培养时接种处位于培养基中部，细菌可辐射状扩散到上、中、下三层培养基中生长繁殖（图1-10）。

5）涂布接种法　该法可用于标本中细菌计数和药敏实验涂布待检菌，具体操作方法不同。

（1）用于细菌计数：用无菌L形玻璃棒（需预先用无菌吸管取一定稀释度的标本液0.1 mL加于平板表面）或用棉签蘸取一定浓度的菌液在平板上反复涂抹，使接种菌液均匀分布于琼脂表面，经培养后即可观察（图1-11）。

（2）用于药敏实验涂布待检菌：用无菌棉拭子蘸取已配制的标准菌液，在平板上划十字形后，向三个方向（每次旋转60°）依次做密而不重的Z字形划线，最后沿平板边缘划线1～2周，此法也称厚涂法。

6）倾注平板法　该法主要用于牛乳、饮水、尿液以及院内感染监测等标本的细菌计数。方法为先将标本适当稀释后，取1 mL或0.1 mL，置于无菌平皿内，倾入已灭菌并冷却至50℃左右的适合培养基15 mL，混匀，待凝固后，倒置平板，于35～37℃培养24～48 h后，计数培养基内菌落数，乘以稀释倍数，即可计算出被检物中的细菌数。

7）自动接种法　全自动接种仪采用环保设计，整个过程实现自动化操作。在电脑程序的控制下，根据不同标本自动选择相应的琼脂平板进行自动接种。与人工接种方法比较，操作过程更安全且标准化，适合大标本量的操作（见图1-12及文后彩图）。