二、常用培养基的制备

（一）实验目的要求

（1）掌握培养基的概念和分类。

（2）掌握常用培养基制备的一般程序。

（3）熟悉常用培养基的制备技术和用途。

（二）实验原理

1.培养基的概念　培养基（culture medium）是根据细菌营养类型，按照一定目的、一定比例人工配制的供细菌生长繁殖的营养基质。培养基主要用于细菌的分离培养、生化鉴定、药敏实验和保存菌种等。

2.培养基的分类　按物理性状不同，培养基可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。按使用目的或功能不同，培养基可细分为基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、特殊培养基、增菌培养基、运送培养基、保存培养基等。

（三）器材与试剂

1.试剂　普通营养琼脂干粉、脱纤维羊血、半固体培养基干粉、SS培养基干粉、克氏双糖铁培养基干粉、麦康凯（MAC）培养基成分（蛋白胨、氯化钠、胆盐、乳糖、5 g/L中性红溶液、琼脂粉）、1 mol/L NaOH溶液、蒸馏水。

2.器材　小型药物天平、药匙、称量纸、三角烧瓶、量筒、吸管、精密pH试纸、试管、硅胶塞、牛皮纸（或报纸）、棉线、玻璃棒、耐高压玻璃纸、无菌平皿、高压蒸汽灭菌器、沸水浴锅（或流动蒸汽灭菌器、微波炉、电炉）、生物安全柜等。

（四）步骤与方法

1.培养基制备的一般程序及方法

1）称量　根据培养基配方或培养基干粉制剂用法，准确计算、称量各组分或干粉制剂，装于三角烧瓶中，加入定量蒸馏水充分混合。

2）溶解　将盛有混合物的三角烧瓶置于沸水浴锅（或流动蒸汽灭菌器、微波炉、电炉）中加热，使混合物溶解，呈半透明状。

3）校正pH　常用精密pH试纸（5.5～9.0）测定。若偏酸，常逐滴加入1 mol/L NaOH溶液校正pH；若偏碱，常逐滴加入1 mol/L HCl溶液校正pH。若培养基用混合干粉成品配制，则一般无须校正pH（注意高压蒸汽灭菌后，培养基pH会下降0.1～0.2，因此调定pH时要高出0.1～0.2）。

4）分装　根据不同形式的培养基选择不同的分装方法。

（1）液体培养基和半固体培养基：灭菌前分装于洁净试管中，分装到距试管底部1/4～1/3处，加塞，5～10支试管用牛皮纸或报纸盖帽、棉线扎捆，标示培养基名称、日期，灭菌后直立放置。

（2）固体斜面培养基：灭菌前分装于洁净试管中，分装到距试管底部1/3～1/2处，加塞、扎捆、标示。灭菌后趁热摆成斜面，斜面长度为试管长度的2/3，并保持斜面上端距离试管塞1 cm以上，斜面下端距离试管底部1 cm以上。

（3）琼脂高层培养基：灭菌前分装于洁净试管中，分装到距试管底部2/3处，加塞、扎捆、标示。灭菌后直立放置。

（4）固体平板培养基：将培养基分装于三角烧瓶（要低于三角烧瓶最大容量），先用耐高压玻璃纸或棉塞封口，再用牛皮纸盖帽、棉线扎口。灭菌后将培养基冷却至60℃左右，最好在生物安全柜或无菌操作台等无菌环境中倾倒于无菌平皿（内径为9 cm的平皿倾倒15～20 mL培养基），使培养基均匀平铺于皿底。待培养基凝固后将平皿倒置，以免水蒸气积聚于盖内，并在皿底标示。

5）灭菌　根据培养基配方选择灭菌方法和条件。

（1）培养基中若含有不耐热成分，常采用过滤除菌法，常用过滤器孔径为0.22 μm和0.45 μm。

（2）无不耐热成分培养基通常采用高压蒸汽灭菌法，根据配方选择温度、压力和时间，灭菌后尽快取出，不可放置过久。一般灭菌条件为103.43 kPa（121.3℃）15～20 min；若含糖培养基要降低到68.95 kPa（115.6℃）10～15 min，以免破坏糖类物质。

6）质量检验　培养基需在性状检查、无菌检验和效能检验均合格后方可使用。

（1）性状检查：液体培养基外观应清澈透明；半固体培养基应质地均匀、半透明，呈半固态；固体斜面培养基应质地均匀，凝固后斜面稳定、不下滑；平板培养基应质地均匀，表面光滑、平整，薄厚适宜。

（2）无菌检验：将培养基置于35℃恒温箱培养24 h，以无菌生长为合格。

（3）效能检验：将标准菌株接种于待检培养基中，经培养后，以标准菌株的生长现象、生化反应与预期结果相符者为合格。

7）保存一般培养基置于4～8℃冰箱保存备用。大多数平板培养基密封倒置可保存1～3个月。除必须新鲜配制或保存时间有限的培养基外，试管培养基可保存3～4个月，甚至半年。

2.常用培养基的制备

（1）营养肉汤培养基：用量筒准确量取所需蒸馏水，先倒入三角烧瓶一部分，随后按照营养肉汤成分配方或干粉制剂说明书准确计算、称量所需粉剂，置于已经盛有部分蒸馏水的三角烧瓶中，最后将量筒内剩余蒸馏水全部倒入三角烧瓶，充分混匀、加热溶解后，用1 mol/L NaOH溶液校正pH至7.5～7.6（高压后可降到培养基要求的pH 7.4），分装于试管中，加塞、扎捆、标示后在121℃下高压蒸汽灭菌20 min。取出后直立放置，待冷却后置于4℃冰箱保存备用。可用于细菌的增菌培养。

（2）营养琼脂培养基：用量筒准确量取所需蒸馏水，先倒入三角烧瓶一部分，之后按照营养琼脂成分配方或干粉制剂说明书用法准确计算、称量所需粉剂，置于已经盛有部分蒸馏水的三角烧瓶中，最后将量筒内剩余蒸馏水全部倒入三角烧瓶，充分混匀、加热煮沸溶解后呈半透明状，校正pH至7.2～7.4。若制成固体斜面，先分装于试管中，加塞、扎捆、标示后高压蒸汽灭菌121℃20 min，高压后趁热摆成斜面，凝固后置于4℃冰箱保存备用；若制成固体平板，先装于三角烧瓶混匀，在121℃下高压蒸汽灭菌20 min，灭菌后置于无菌环境倾注平板，凝固后标示、倒置于4℃冰箱保存备用。可用于一般细菌的分离培养。

（3）半固体营养琼脂培养基：具体做法同肉汤培养基。可用于观察细菌的动力和保存菌种。

（4）血琼脂平板：将灭菌后的营养琼脂冷却到50℃左右，以无菌操作加入10%的无菌脱纤维羊血（或兔血），立即混匀，避免产生气泡，然后以无菌操作分装于无菌试管或平皿，制成血琼脂斜面或血琼脂平板。血琼脂斜面可用于保存营养要求高的细菌；血琼脂平板可用于分离培养细菌和检测其溶血性。

（5）巧克力琼脂平板：基于血琼脂平板制备基础之上，特点在于灭菌后的营养琼脂冷却到70～80℃时加入无菌脱纤维血液，且在80℃水浴中摇匀15～20 min，使血液的色泽由鲜红转变为巧克力色，然后冷却至50℃左右，无菌操作倾注平板即制成巧克力琼脂平板。可用于分离培养奈瑟菌属、流感嗜血杆菌属等对营养要求较高的细菌。

（6）麦康凯（MAC）琼脂平板：按照配方基本成分自行配制时，先将除乳糖、中性红之外的其他成分混合加热溶解，调pH至7.2之后，再加入乳糖、中性红，混匀后在115℃下高压蒸汽灭菌15 min，高压后冷却至50℃左右，以无菌操作倒入平板，凝固后标记、倒置于4℃保存，主要用于肠杆菌科细菌的分离培养与鉴定。

3.培养基制备注意事项

（1）要防止加热溶解时培养基黏在瓶底烧结，可先在三角烧瓶中加入量好的部分蒸馏水，再加入称量好的固体成分，最后将量筒内剩余的蒸馏水全部倒入三角烧瓶。

（2）制备培养基最好用玻璃器皿（三角烧瓶或烧杯）。若制备大量培养基时可用铝锅或搪瓷桶，但不能用铁、铜器皿，因为铁离子进入培养基，达到一定浓度会抑制细菌生长，而铜离子会抑制细菌毒素产生。

（3）在按照配方自行配制培养基时，若培养基中有染料、胆盐和指示剂等成分，应在校正pH后加入。

（4）倒入平板时，一定要无菌操作，最好在无菌环境（生物安全柜、无菌操作台）中进行，若无无菌设备，倒入时平皿开口越小越好，能倒入培养基即可，以防止空气中细菌、真菌等污染培养基。

（5）倒入平板时，灭菌后的培养基要冷却至60℃左右再倒入平板。若温度过高，平板内壁会出现很多冷凝水，不适合平板长期保存；若温度过低，则培养基在未倒入前就会出现凝块，倒入凝固后培养基表面会凹凸不平，无法使用。