甲基化反应（Methylation Conjugation）是药物代谢中较为少见的代谢途径，但是对一些内源性物质如肾上腺素、褪黑激素等的代谢非常重要，对分解某些生物活性胺以及调节活化蛋白质、核酸等生物大分子的活性也起到非常重要的作用。

同乙酰化反应一样，甲基化反应也是降低被结合物的极性和亲水性，只有叔胺化合物甲基化后生成季铵盐，有利于提高水溶性和排泄。如镇痛药美沙酮经甲基化反应生成N-甲基美沙酮。

甲基化反应一般不是用于体内外来物的结合排泄，而是降低这些物质的生物活性。参与甲基化反应的基团有酚羟基、胺基、巯基等，反应大多需在特异性或非特异性的甲基化转移酶催化下进行。例如肾上腺素在儿茶酚-3-O-甲基转移酶（COMT）的催化下，生成3-O-甲基肾上腺素。麻黄碱在苯乙醇胺-N-甲基转移酶（PNMT）催化下，生成叔胺型的N-甲基麻黄碱。值得注意的是，通常酚羟基的甲基化反应主要对象是具儿茶酚胺结构的活性物质，如肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺等。且甲基化反应具有区域选择性，仅仅发生在3-位的酚羟基上。

非儿茶酚胺结构的药物，一般不发生酚羟基的甲基化，如支气管扩张药特布他林含有两个间位酚羟基，不发生甲基化反应。

结合反应需要消耗内源性的小分子，如葡萄糖醛酸、硫酸盐、氨基酸等。在较大剂量使用（误用）药物时，即意味着药物代谢中需要比正常量多的内源性小分子化合物，超过了机体中这些小分子的供给能力，就会产生药物中毒。如对乙酰氨基酚的服用剂量过大，会导致肝中毒。因为在正常剂量下对乙酰氨基酚是通过与葡萄糖醛酸或硫酸结合后排出体外，只有约5%的量与谷胱甘肽结合被排除。在服用量远远超过治疗剂量时，体内供结合用的葡萄糖醛酸和硫酸盐被耗尽，使得代谢物与谷胱甘肽的结合成为主要的代谢途径。但当肝脏内谷胱甘肽的消耗得不到及时补充时，会使代谢物N-乙酰对苯醌亚胺在体内蓄积，该代谢物可与细胞内大分子共价结合，导致严重的肝毒性。如出现过量服用对乙酰氨基酚的情况，应及早服用N-乙酰半胱氨酸来除去体内蓄积的N-乙酰对苯醌亚胺，避免中毒的发生。