这段在米兰的日子就是“第二米兰时期”了，此次达·芬奇共在米兰生活了约7年，从1506年直到1513年。

这7年达·芬奇也是颇为惬意的，收入不少，事儿却不多。他不用为生计而发愁，法国人付给他的薪水一年达400达克特银币，这一定是笔相当可观的巨款。

他现在极少画画，因为凭着薪水就能养活很多人。这时他在米兰的画室里已经聚集了不少弟子，有名的如萨莱、孔蒂、F.梅尔齐等，达·芬奇在世界上没什么亲人了，弟子就是他最亲的人。

这个时期，达·芬奇除偶尔为米兰政府的一些建筑工程提出建议或者绘制一下草图外，其他时间基本上都用在科学研究上了，他对解剖学、数学、光学、机械学、植物学甚至地质学的研究日益深入，并且在这些领域之内几乎都达到了当时的最高峰。

达·芬奇也许以为，他将能够这样逍遥自在地在米兰度过他的余生了，但命运再次捉弄了他。

1513年，早在1499年被打败的斯福查的儿子马克西米利亚诺·斯福查统兵杀回，重新占领了米兰。虽然仅仅两年之后，法王路易十二的儿子弗兰西斯一世又打败了小斯福查，重占米兰，但这次1513年的占领却令达·芬奇再次走上了奔波之路。因为他接到了新上任的教皇利奥十世的兄弟、美第奇家族的朱利亚诺·德·美第奇的盛情邀请，请他去罗马为教皇工作。

于是，1513年，年届六旬的达·芬奇离开了米兰，往罗马而去，在这年底到达了罗马，随行的有他最心爱的两个弟子梅尔齐和萨莱。