拓展阅读三 PCR方法的发明
PCR技术的发明是生命科学领域中的一项革命性创举和里程碑。
PCR技术是1985年由美国科学家Kary B Mullis建立的。Mullis 在1979年获得博士学位后，在Cetus生物技术公司从事寡核苷酸探针合成工作。DNA合成仪的迅速普及促使Mullis中断了寡核苷酸合成工作，改做其他项目研究。
1983年4月的一个周末，Mullis考虑是否可以有一种方法对微量生物样品中的DNA的结构进行鉴定，因为很多致病基因的鉴定都只能在很少的样品中进行。最初他想利用Sanger做DNA序列分析的原理，但是做序列分析时，引物的结合并不能保持足够的特异性。于是，他想到在目的基因的下游再增加一条引物，这条引物结合在互补链上，两次序列分析的结果可以相互补而确认。然而DNA样品中含有的脱氧核苷酸底物可能会干扰双脱氧核苷酸的参入。解决的办法是将实验分两步进行，第一步先在反应体系中加入脱氧核苷酸，反应完成后可以获得的不同长度的DNA片段；然后加热使各种不同长度的两条链解链，再加入新的寡核苷酸引物和核素标记的双脱氧核苷酸得到标记片段进行分析。不过，如果脱氧核苷酸的量已经足以合成新链全长，就无法进行上述分析。想到这里，Mullis突然意识到，尽管这样的合成的DNA链不能用于分析DNA的序列，但是如果反复进行这一反应，无疑位于两个引物之间的序列会得到扩增，扩增出来的DNA应该是位于两条引物间特异性序列。
Mullis认为这个想法相当简单，不可能是创新性的。回到公司，他向同事们询问，却没有人听说过类似的方法。大家都认为这一想法是可行的，但是也没有人对此表示出特殊的热情。Mullis用了数月时间进行了准备，结果实验一举成功。该方法首次发表在1985年的Science上，用于镰刀状贫血的基因诊断获得了良好效果。
PCR技术的建立在科学史属于一种“postmature”发展方式。即该项发现或发明出现时的一切理论基础都已经具备，只是没有人实现这一发明或发现。可见，科学家们需要更活跃的思维来充分利用前人的知识和见解。
在60年代初，Kornberg A等人已经讨论过利用DNA聚合酶I获得大量DNA的可能性。1971年，Khorana H和他的同事已经建议利用双链DNA互补的寡核苷酸引物复制DNA，在论文的最后，甚至已经提到了将引物结合、DNA聚合酶延长和双链变化这三个主要的PCR步骤重复进行的思路。不过，他们的目标与Mullis的不同，Khorana仅仅需在体外拷贝一个已知的DNA分子，而Mullis的目标则是扩增出无数的DNA分子以供鉴定。
Mullis的PCR实验最初并没有造成轰动。Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其主要缺点是：①不耐高温，加热时会变性失活，每次循环都要重新加入；②引物链延伸反应在37oC下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。这些缺点给PCR技术操作程序带来不少困难，使得PCR技术在相当一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。
后续10年中的一系列发现推动了PCR技术的普及，尤其是1988年Saiki R等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌（Thermos aquaticus）中提取到一种耐热DNA聚合酶。热稳定性DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）取代了大肠杆菌DNA聚合酶，因此不必在每一延长反应开始时加入新酶。扩增的特异性和效率，因而其灵敏感性也大大提高。从这一角度讲，Mullis是十分幸运的。因为在科学史上曾有许多伟大的想法由于缺乏可行的工具而被遗忘。前面谈到的Mullis的同事们对PCR最初的冷淡并非是由于他们缺乏远见，而是由于他们过于现实。20世纪90年代中期以后，多种自动化PCR反应仪面市，大大推动了PCR技术的普及和发展，也由此带来了诸多分子生物学的理论突破。
Mullis在1993年获得诺贝尔化学奖。这是当时唯一一个颁发给生物技术公司研究工作的诺贝尔奖。当时有人指出，PCR仅仅是实验中的一个小技巧（trick），与以往的诺贝尔奖研究项目相比，其中的知识和智慧含量似乎并不丰富。但是无论如何，PCR对于分子生物学的影响远远超过了其它所有的技术。尽管大家认为它只是一种简单的技巧，但是毕竟没有人能够更早发明它。由此可见，科学技术的发展在扎实努力刻苦奋斗的同时，“奇思妙想”亦是不可缺少的！
【推荐阅读】
1. Michel Morange. A History of Molecular Biology. Boston,
Harvard University Press, ( translated by Matthew Cobb from French). 1998
2. Randall K. Saki, David H. Gelfand, Susanne Stoffel,
Stephen J, Scharf, Russell Higuchi, Glenn T. Horn, Kary B. Mullis, and Henry A.
Erlich. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA
polymerase. Science. 239:487-491. 1988
（药立波）