拓展阅读二 核酸探针标记物
为了便于示踪检测，核酸探针必须采用一定方法加以标记，以利于杂交结果的显示。一种理想的核酸探针标记物应具备以下特点：① 高度灵敏性；② 高度特异性且标记物与核酸探针结合后应绝对不能影响核酸探针与模板的结合能力及结合的特异性；③ 当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（Km值）无影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性；④ 较高的化学稳定性，保存时间长；⑤ 标记及检测方法简单；⑥对环境无污染，对人体无损伤等。
目前常采用的探针标记物主要放射性核素。它可以检测出1~10μg的高等生物基因组DNA中的单拷贝序列。另外一些非放射性标记物如生物素、地高辛和荧光素等已在国内外广泛推广应用，并取得了理想的结果。
（一）放射性核素
放射性核素是一类灵敏度极高的探针标记物。在最适条件下，可以检测出样品中少于1 000个分子的核酸。放射性核素与相应的元素之间的差别只在于中子数上，而质子和电子数完全一致，两者具有完全相同的化学性质。放射性核素对各种酶促反应无任何影响，也不影响碱基配对的特异性、稳定性和杂交性质。此外，放射性核素的检测具有极高的特异性，假阳性率较低。其主要缺点是存在放射线污染，且半衰期短，探针必须随用随标记，不能长期存放。目前实验室中常用于核酸标记的放射性核素主要有32P、3H和35S等。
（二）非放射性标记物
多年来科学家们一直在寻找一种安全可靠、灵敏度高的标记物以替代放射性核素用于核酸探针的标记。部分非放射性标记物已经在国内外广泛使用，并取得了很好效果。非放射性标记物的优点为：① 安全、无污染、使用及后处理方便；② 稳定性好，标记好的探针可保存一年甚至更久，可降低工作强度、批次检测之间重复性好；③ 利用几种不同探针标记方法，可一次对同一样本进行多探针杂交。非放射性标记物的主要缺点为灵敏度及特异性有时不太理想，标记反应结束后不能立即确定探针的标记效率。
生物素是最先被用于核酸探针标记的非放射性标记物。在溶液中，生物素可以与抗生物素蛋白（avidin）和链亲和素（streptavidin）特异性结合，因此可以通过偶联有荧光素或特定的酶如碱性磷酸酶（alkaline
phosphatase，AP）或辣根过氧化物酶（horseradish
peroxidase，HRP）的抗生物素蛋白或链亲和素来进行检测。生物素可使标记的DNA分布于有机相与无机相的交界面或完全在有机相中，因此生物素标记的DNA不能用酚进行抽提。但由于生物素是一种维生素分子，普遍存在于各种细胞中，因而在原位杂交时内源性背景较大。
荧光色素类主要包括异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、罗丹明（rhodamine）类等。其工作原理（以荧光素为例）是通过酶促合成将荧光素化的dNTP掺入到探针分子中，杂交后直接在荧光显微镜下观察结果。不同荧光色素在激发光下可发出不同颜色的荧光特征，利用不同颜色荧光色素标记的探针可进行多重原位杂交，同时检测多个基因的表达。荧光探针多用于染色体、基因芯片、培养细胞或冰冻切片标本的检测分析。该法简单快捷，但没有放大过程，灵敏度较低，仅适用于检测高拷贝序列；而且荧光强度随着激发光照射时间的增加而衰退。
非放射性标记物发展方向为灵敏度高、稳定性好、实验周期短、检测方法简单、安全。在这些系统中以新的荧光色素类标记物最具潜力。
【推荐阅读】
1. J. 萨姆布鲁克, D.W. 拉塞尔. 分子克隆实验指南 (第四版). 北京: 化学工业出版社, 2008
2. Southern E. Southern blotting. Nat Protoc, 1:518.
2006
（药立波）