冈崎片段的发现者及其发现过程

冈崎令治,日本分子生物学家,出生于广岛市白岛(现中区白岛),日本分子生物学的先驱者之一。1966年,他发现了DNA合成中后随链上形成的短片段——冈崎片段(okazaki fragment),并在《美国科学院院刊(Proc Natl AcadSci USA)》上连续发表了4篇相关发现的文章。1975年,正当人们都纷纷预测冈崎令治可能获得诺贝尔奖的时候,冈崎令治罹患白血病去世。
冈崎片段的发现主要基于以下三个实验:
1. 脉冲标记实验(pilse-labelingexperiment)
利用T4噬菌体侵染E.coli(t-)菌株,并分别用放射性核素标记的dTTP(3H-T)进行2s,7s,15s,30s,60s,120s的脉冲标记,分别提取了T4噬菌体DNA,变形后,进行CsCl密度梯度离心,以检测具放射性的沉降片段,判断片段大小。结果表明经不同标记时间,被3H-T标记的新合成的DNA片段几乎都为10~20S,即均为1000~2000核苷酸大小(后被称为“冈崎片段”)。接下来进行了脉冲追踪实验(pulse-chase experiment),以确认在脉冲标记实验中所发现的10~20S的小片段在复制全过程中的发展结局。先将实验菌株先进行核素标记培养30秒,然后转入正常培养基继续培养数分钟,分离DNA进行密度梯度离心,发现小片段已被连接成为70~120S的大片段。为此将DNA的这种复制方式成为不连读复制模式,将最初合成的10~20S片段称为冈崎片段。
2. 抑制DNA连接酶导致新生短链积累的实验
脉冲标记实验支持了DNA链的不连续复制假设,如果在体内抑制DNA连接酶的活性,将能够导致新生短链的积累。利用热敏DNA连接酶基因突变(tsA80,tsB20)的T4噬菌体突变株侵染的大肠杆菌细胞,在温度从20℃到43℃后1分钟,开始脉冲标记,验证了这个预测。
3. 探测尿嘧啶片段的实验
为了探究这种短片段是仅仅在一条链上合成时出现,还是在两条链上均出现,冈崎使用有突变的大肠杆菌菌株。在这些突变株中,新掺入的带有同位素标记的片段中,短片段出现的比例是50%,也就是冈崎片段在新合成的DNA中占50%,证明了一条链是连续合成的,另一条链是不连续复制的。由于连续复制的链3′-OH末端常常处在复制前沿,因此被叫做前导链,而不连续合成的链是之后的,被称为后随链。
【推荐阅读】
1. Okazaki R, Okazaki T, Sakabe K, Sugimoto K. Mechanism ofDNA replication possible discontinuity of DNA chain growth. Japanese Journalof Medical Science & Biology. 20 (3): 255–60. 1967
2. Okazaki R, Okazaki T, Sakabe K, Sugimoto K, Sugino A.Mechanism of DNA chain growth. I. Possible discontinuity and unusual secondarystructure of newly synthesized chains. Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America. 59 (2): 598–605. 1968
(齐炜炜 高国全)