（三）重组DNA技术基本原理及操作步骤

★★★一个完整的DNA克隆过程包括：目的基因的获取——分；基因载体的选择与构建——切；目的基因与载体的拼接——接；重组DNA分子导入受体细胞——转；筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）——筛。

1．目的基因的获取　大致有以下几种途径或来源：

化学合成法。已知某种基因的核苷酸序列或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出为该多肽链编码的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。

基因组DNA文库。存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。

cDNA文库。以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA（cDNA），再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌——cDNA文库。

PCR。是一种体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术。

2．克隆载体的选择和构建　外源DNA片段离开染色体则不能复制，须与载体结合，目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。

3．外源基因与载体的连接——DNA的体外重组

黏性末端连接

·同一限制酶切割位点连接：由同一限制性内切核酸酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端；产生单链突变的黏性末端，且酶切位点附近的DNA序列不影响连接→退火连接。

·不同限制性内切酶位点连接：由两种不同的限制性内切核酸酶切割的DNA片段，具有相同类型的黏性末端，即配伍末端，也可连接。如MboⅠ和Bam HⅠ产生的5′突出的GATC黏性末端，可相互连接。

平端连接：DNA连接酶可催化相同和不同限制性内切核酸酶切割的平端之间的连接。

同聚物加尾连接：在末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出黏性末端，再进行黏性末端连接。属于黏性末端连接的一种特殊形式，人工法。

人工接头连接：对平端DNA片段或载体DNA，可在连接前将磷酸化的接头或适当分子连到平末端，产生新的限制性内切核酸酶位点，再用识别新位点的限制性内切核酸酶切除接头的远端，产生黏性末端。也属于黏性末端连接的一种特殊形式。

4．重组DNA导入受体菌

受体菌应是：安全的、限制酶和重组酶缺陷型。

常用：大肠杆菌K－12改造的安全宿主菌。

受体菌经特殊处理→感受态细胞（具备接受外源DNA的能力）。

导入方式：转化、转染（transfection）、感染（infection）。

5．重组体的筛选　鉴定含重组DNA分子的菌斑或噬菌斑中确实带有目的基因的过程。根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采用：

直接选择法。针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法。

特点：直接测定基因或基因表型。

·耐药性标志选择：载体携带某种抗药性标志基因，通过加入该药的培养基培养可区分转化菌与非转化菌；若外源基因插入标志基因内而致失活，则通过有、无该药的培养基对比培养区分单纯载体或重组载体。——初步、粗略的选择。

·标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，则可利用营养突变菌株进行筛选。

·分子杂交法：利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交，直接选择并鉴定目的基因。如原位杂交（in situ hybridization）、Southern印迹技术（Southern blotting）。

免疫学方法。利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选。该法特异性强、灵敏度高，尤其适用于选择不为宿主菌提供任何选择标志的基因。有免疫化学方法和酶免检测分析。

6．克隆基因的表达

原核表达体系：E．coli最为常用。

优点：培养方法简单、迅速、经济且适合大规模生产。

缺点：①缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA；②缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰；③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体；④很难表达大量的可溶性蛋白。

真核表达体系：如酵母、昆虫、哺乳动物细胞（COS细胞、CHO细胞）。

优点：①可表达克隆的cDNA，也可表达真核基因组DNA；②表达的蛋白质总是被适当的修饰；③表达的蛋白质会恰当地分布在细胞内一定区域并积累。

缺点：操作技术难、费时、不经济。