第二十五章 基因结构功能分析和疾病相关基因鉴定克隆（自学）

（一）教学要求

在知识传授方面，通过本章节的学习，使学生掌握鉴定疾病相关基因的原则。熟悉疾病相关基因克隆的策略和方法。了解疾病相关基因的功能研究方法。了解基因分析技术；了解基因表达产物分析技术；了解基因生物学功能鉴定技术。

（二）知识点提示

基因的一级结构是指脱氧核苷顺序。解析一级结构最精确的技术是DNA测序。常规DNA测序包括Sanger双脱氧法和化学降解法。目前，应用最多的是基于Sanger双脱氧法的自动激光荧光DNA测序技术。近年，其他DNA测序新技术也得到了迅速发展。包括焦磷酸渊序技术、循环芯片测序技术和单分子测序技术。

基因中包括编码序列和非编码序列。基因的转录起始序列和启动子均属非编码序列。

研究真核生物结构基因转录起点序列的技术包括cDNA克隆直接测序法、5-cDNA末端快速扩增法、连续分析法、数据库搜索法等；研究启动子结构的技术包桥启动子克隆法、核酸-蛋白质相互作用分析法、生物信息学预测法等。分析编码序列的技术包括dDNA文库法、RNA剪接法、数据库搜索法等。分析基因拷贝数的技术包括Southern印迹、PCR和DNA测序法等。

通过检测RNA和蛋白质/多肽可分别揭示基因在转录水平和翻译水平的表达特征。检测RNA的技术包括RNA印迹、原位杂交、核糖核酸酶保护实验、cDNA芯片等；检测蛋白质/多肽的技术包括验蛋白质印迹、酶联免疫吸所实验、免疫组化、流式细胞木、蛋白芯片等。

鉴定基因功能的策略包括功能获得策略(如转基因、基因融入技术)、功能失活策略(如基因敲除、基因沉默技术)及随机突变体筛选策略等。

疾病相关基因的鉴定和克隆，可采取非染色体定位的基因功能鉴定和定位克隆两类策略。前者包括功能克隆、表型克隆及采用位置非依赖的DNA序列信息和动物模型来鉴定和克隆疾病基因，后者则是先进行基因定位作图，确定疾病相关基因在染色体上的位置，然后寻找来自该区的基因并进行克隆，采用包括体细胞杂交法、原位杂交法、连锁分析及染色体异常定位来克隆疾病相关基因。假肥大肌营养不良基因的克隆是定位克隆策略应用的成功范例。

基因的功能由基因表达产物体现，也就是编码基因的蛋白质功能和非编码基因 RNA的功能。基因产物的功能可以从三个不同水平来描述，即生物化学水平、细胞水平和整体水平的功能。生物信息学的同源序列比对、细胞水平高表达或低表达基因（反义技术和RNA干涉）技术、蛋白质与蛋白质相互作用技术和整体水平的转基因技术、基因敲除小鼠动物模型等，都是目前进行基因功能研究的有效手段。

（三）教学内容

第一节基因结构分析鉴定基因的顺式元件是了解基因表达的关键；检测基因的拷贝数是了解基因表达丰度的重要因素；分析基因表达的可采用组学方法和特异性测定方法。

第二节基因功能研究生物信息学全面了解基因已知的结构与功能；基因作用的本质是其编码产物的生物化学功能；利用工程细胞研究基因在细胞水平的功能；利用基因修饰动物研究基因在体功能。

第三节疾病相关基因鉴定和克隆原则鉴定克隆疾病相关基因的关键是确定疾病表型和基因间的实质联系；鉴定克隆疾病相关基因需要多学科多途径的综合策略；确定候选基因是多种克隆疾病相关基因方法的交汇。

第四节疾病相关基因鉴定克隆的策略和方法不依赖染色体定位的疾病相关基因克隆策略；定位克隆是鉴定疾病相关基因的经典方法；确定常见病的基因需要全基因组关联分析和全外显子测序；生物信息学数据库贮藏丰富的相关基因信息。

（四）思考题

1. 简述第一第二和第三代DNA测序技术的原理成主要用途。

2. 简述分析基因TSS、启动于、编码序列以及拷贝数的主要方法及原理。

3. 如何在转录和翻译水平分析基因的表达特征？

4. 简述鉴定基因功能的主要策略及其原理。

5. 请设计一个综合方案来解析基因的结构和表达特征，并最终鉴定其功能。

6. 如何理解疾病相关基因的概念？

7. 对疾病相关基因进行定位的步骤和方法有哪些？

8.对疾病相关基因的功能进行研究目前有哪些手段？