第五节　孕期B19病毒宫内感染的诊断

一、B19病毒感染的诊断标准

1.B19病毒宫内感染的诊断依据

B19病毒宫内感染的诊断依据为从胎儿、胚胎或其附属物(绒毛、胎盘、羊水、脐血等)组织中检测出B19DNA。

2.诊断标准

B19病毒感染由于缺乏普遍适用的特异的病理学诊断作为诊断的金标准，可采用公认的、以国内常用的结构蛋白巢式PCR检测方法并结合孕妇的典型临床表现和症状作为诊断标准，运用巢式聚合酶链式反应(Nested-PCR)技术检测B19病毒非结构蛋白DNA，并对其进行评价。

3.人微小病毒B19非结构蛋白巢式PCR

非结构蛋白巢式PCR在质粒的阳性模板中，B19DNA的最小检出量为0.005fg，该方法所用的引物与人类基因组及国内常筛查的病毒(人巨细胞病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒)无同源性。

大量研究证实B19病毒非结构蛋白NS1具有细胞毒性，在病毒的致病性中具有非常重要的作用，近年来国际上对B19病毒非结构蛋白致病性的研究非常活跃。已建立一种新的B19病毒检测方法，为进一步研究非结构蛋白的致病机制及临床筛查B19病毒感染进行血清流行病学研究提供新的诊断技术。

二、B19感染临床诊断

①病毒血症发生在感染后的第一周，伴有发热、不适及骨髓中红系祖细胞缺失。②病毒血症高峰，出现网织红细胞计数急剧下降、贫血，偶尔还伴有白细胞及血小板减少。③“刮耳”状皮疹出现时，病毒血症消失。④IgM在接种后第10～14天出现，与病毒血症消失有关，IgM可能会保存几个月。⑤IgG在接种后第三周出现，保留终生，同时出现传染性红斑及关节病。传染性红斑的诊断主要根据临床表现，由于皮疹出现与IgG抗体有关，并出现在病毒血症消失后，因此传染性红斑的出现说明病毒不再具有传染性。

短暂性再障危象或关节炎的诊断主要依据血清学试验。B19特异性抗体IgG或B19特异性抗体IgM滴度上升，则表明存在急性期或近期感染。慢性贫血患者进行骨髓测试，找到原始红细胞，则表明存在B19感染。用PCR方法检测母体血清中的B19DNA，阳性者为感染标志。

三、人微小病毒B19的实验室检测

诊断为B19病毒感染者必须同时具备以下两个条件:①运用结构蛋白巢式PCR在孕妇血清及胎盘或绒毛组织中均检测出B19病毒结构蛋白DNA;②孕妇出现了B19病毒近期感染的临床症状如关节痛、发热、传染性红斑、流感样症状等。

非B19病毒感染的诊断必须同时具备以下两个条件:①运用结构蛋白巢式PCR在孕妇血清及胎盘或绒毛组织中均未检测出B19病毒结构蛋白DNA;②患者身体健康，既往无不良妊娠史，近期无任何B19病毒感染的临床症状，无B19病毒暴露史，妊娠过程顺利。

B19病毒检测方法的建立及各种检测方法之间方法学的比较:在血清学抗体检测中目前最常用的方法为ELISA。在抗原B19病毒DNA检测中最为常用的病原检测方法是巢式PCR，它能快速诊断病毒感染。联合应用PCR及ELISA技术对病毒的抗原及抗体进行检测是病毒感染诊断最为可靠的方法。最近新发展起来的实时荧光定量PCR，在实验中设立了内对照，更好地控制了假阳性及假阴性结果，对监测严重和慢性B19病毒感染的治疗效果，十分有意义，但由于其价格昂贵，目前只应用于科研。

由于人微小病毒B19的组织特异性，不能在传统的培养细胞上增殖，长期以来病毒血症的献血员和病人是B19病毒的惟一来源。尽管已有研究报道可应用基因工程技术合成重组的空衣壳蛋白供临床实验，国外已研制出针对B19病毒结构蛋白及非结构蛋白的ELISA检测方法，在我国，由于没有自主知识产权的基因工程抗原ELISA诊断试剂盒，进口试剂盒价格昂贵，并且来源有限，很难作为常规检测方法。目前国内基因检测是诊断B19病毒感染的主要方法。1989年Salimans等建立了PCR检测B19DNA的新技术，特异性、灵敏性得到很大的提高;1991年Patou等又发明了巢式PCR检测技术，较前有了进一步的发展，成为目前国内外诊断B19病毒感染的经典方法。巢式PCR先对一段较长片段DNA扩增后，特异地对其中一部分片段进行第二次扩增，不仅灵敏性提高10～100倍，特异性也得到了很大的提高。巢式PCR的第二对引物相当于一对探针，只有当第一次PCR循环产物中有大片段DNA时，第二次PCR循环才有可能阳性，因而巢式PCR产物不需要核酸探针检测。而且本实验还取第一次PCR循环产物作为模板，再设立两个半巢式PCR反应体系，结果巢式PCR的外反应、内反应及两次半巢式PCR反应出现了与理论相符的4条目的条带，相当于对外引物产物284bp进行酶切图谱分析，结果完全符合基因序列扩增理论，进一步证实了本检测方法所用引物的特异性。

将非结构蛋白巢式PCR检测方法及国内传统的结构蛋白巢式PCR检测方法，作为平行试验，检测孕妇血清及部分胎儿组织或胎儿附属物中的人微小病毒B19DNA，以探讨武汉地区孕妇人微小病毒B19的感染状况、临床表现及母婴垂直传播途径，进一步证实人微小病毒B19与不良妊娠结局之间的关系，并探讨人微小病毒B19宫内感染的致病机制。

四、非结构蛋白巢式PCR检测技术的评价

探索新的人微小病毒B19非结构蛋白巢式聚合酶链式反应检测方法运用于临床筛查B19病毒感染的可行性，运用国内常用的结构蛋白巢式PCR检测方法并结合孕妇的典型临床表现作为诊断标准，将其中30例孕妇分为B19病毒感染组及非感染组。然后评价新建立的非结构蛋白巢式PCR的效度及效率，结果发现仅检测血清标本的灵敏度高于仅检测胎盘或绒毛组织，可能是因为血清标本采集及检测过程均较简单，而且在病毒DNA的提取过程中，血清标本使用PCR抑制剂较少，避免了病毒DNA片段的降解和对PCR检测的抑制。因此，临床上检测B19病毒DNA，母血清标本优于组织标本，而且前者更易于采集、储存，标本中病毒DNA的提取也较简单，可以节　约人力、物力及财力。采用两份标本的联合试验有利于提高检测的灵敏度及特异度。本研究中，平行试验的灵敏度和阴性预测值均达到了100%，而系列试验的特异度和阳性预测值达到了100%。

在研究中，非结构蛋白巢式PCR在非感染组中的2份孕妇血清及另外1份绒毛组织中检测到B19病毒DNA，在感染组的1份绒毛组织中没有检测到目的基因片段。不能简单地将前3例病例判断为误诊病例，而后者判断为漏诊病例，因为:

①B19病毒的无症状感染率高，为20%～60%。②在病毒感染的潜伏期和恢复期，患者体内病毒数目较少，单一的抗原检测结果难以说明问题，而且在慢性持续性感染患者体中，B19病毒常常在非允许细胞中复制并转录出大量非结构蛋白，此时，对非结构蛋白DNA或mRNA的检测更有意义。③在标本的保存及DNA提取过程中，可能会发生病毒DNA的降解，可能该3份标本中结构蛋白引物扩增的DNA片段被破坏，而非结构蛋白引物扩增的DNA片段仍保持完好。对非结构蛋白巢式PCR检测结果阴性的1份标本，同样要考虑标本中病毒DNA的降解。因而，可对这样的患者再次进行抗体检测，以进一步明确诊断。但在我国，进口的B19病毒结构蛋白及非结构蛋白ELISA检测试剂盒非常昂贵，对孕妇进行常规B19病毒抗体检测，目前并不现实。为了减少检测结果的假阴性率，可将结构蛋白与非结构蛋白基因片段的巢式PCR作为平行试验。平行试验的效应由于放宽了阳性而严格了阴性，对阴性结果作出无病的诊断更有把握;而系列试验则放宽了阴性而严格了阳性，往往易于导致病人的漏诊。对于检测出来的感染孕妇，可通过B超监测胎儿的生长发育，出现严重的胎儿水肿者可宫内输血治疗，或孕妇静脉注射丙种球蛋白来中和体内病毒，因此为了达到优生的目的，对可疑病例可采用平行试验，对病毒的两段基因均进行检测，只要其中之一者阳性，即可诊断为阳性。

五、非结构蛋白巢式PCR检测技术的质量控制

在研究的开始阶段，对于用诊断标准判定为B19病毒感染组及非感染组的研究对象，在盲法的前提下对病毒的非结构蛋白DNA进行检测。在将同一批样品在同一实验室由不同实验操作者运用相同条件的非结构蛋白巢式PCR进行重复检测时，亦要遵循盲法的原则，由此可减少由于操作者的主观判断对试验结果产生影响。结果发现两次测定高度相关，两次检测率差异无统计学意义，观察一致性及Kappa值均较高，说明该检测方法的稳定性好。

由于巢式PCR检测技术的敏感性很高，如实验中出现交叉污染，容易产生假阳性，因而对待测样品做结构蛋白和非结构蛋白两次基因片段的巢式PCR检测，更易出现假阳性结果。因此，本研究要特别防止样品的污染，对实验中所有的试剂都进行分装，使用经过高压消毒的一次性吸头及Eppendorf管。样品制备时严格遵守无菌操作原则，避免样品间的互相污染。样品制备、PCR操作及PCR产物的分析尽可能在专门的操作台进行。试验过程中经常更换手套。为了避免假阳性结果是来源于非特异产物，本研究摸索了合适的退火温度、延伸时间和引物浓度。为避免假阴性结果，在样品处理过程中，尽量减少使用PCR抑制剂，每一次试验都设立了阳性对照和空白对照。

六、妊娠期人微小病毒B19非结构蛋白DNA的检测意义

B19病毒的非结构蛋白已被证实具有细胞毒性，而且可引起细胞凋亡，最后导致细胞裂解和NS1抗原的释放。研究表明NS1蛋白可能具有以下功能:在病毒复制过程中作为解旋酶和位点特异的核酸酶而起重要作用;对于人微小病毒结构基因启动子及其自身基因的启动子，NS1起类似增强子元件的作用;从质粒甚至是从染色体整合位点中切除微小病毒基因组都需要非结构蛋白的帮助;NS1能引导DNA进入空的衣壳，组装成新的病毒颗粒;NS1能抑制异种启动子的功能，它是人微小病毒在多种细胞培养体系中引起宿主死亡的重要介质;可诱导细胞凋亡;是炎症因子白细胞介素6(IL-6)的转录启动子。

近年来B19病毒非结构蛋白的致病性引起了学者们的普遍关注，对B19病毒非结构蛋白的特异性抗体的研究发现，在免疫缺陷的慢性持续性B19病毒感染患者或孕妇血清中能检测到NS1抗体。研究发现，在B19病毒感染的孕妇中有61%出现了NS1特异性免疫反应，在胎儿非免疫性水肿的孕妇中有78%检测出抗NS1的特异性抗体IgG。这是因为妊娠引起母体免疫机制低下，不能有效清除病毒，病毒的持续存在可导致非允许细胞的感染，使得B19病毒基因表达优先转录NS1基因，产生大量具有细胞毒作用的非结构蛋白，最终导致胚胎及胎儿的疾病。因此，非结构蛋白基因片断的浓度及抗体可以作为反映妊娠期B19病毒感染持续存在和增加胎儿感染危险性的指标，妊娠期检测非结构蛋白对指导临床上采取干预措施非常必要。本研究建立的B19病毒非结构蛋白巢式PCR，将为进一步研究非结构蛋白的致病机制及临床筛查B19病毒感染奠定实验室诊断基础。

七、人微小病毒B19非结构蛋白ELISA试剂盒的研制

周铁群、于红等通过DNA重组技术，构建了B19病毒VP1独特区和VP1和VP2共同区主要抗原片段基因高效表达菌株，为研制和开发具有我国独立知识产权的B19病毒基因工程抗原ELISA诊断试剂盒提供了有价值的资料。B19病毒的结构蛋白抗原表位区集中在VP1独特区和VP1-VP2连接区，非结构蛋白最具抗原性的部分位于蛋白的羧基末端，这些区域能刺激肌体产生相应的抗体。B19病毒基因变异可以导致ELISA反应出现假阴性结果，因此，研究基因变异在制备诊断试剂及基因工程疫苗等方面有很大的实际意义。Erdman等的研究给中国学者敲响了警钟，他们发现来自我国西安的3株B19病毒在核苷酸及氨基酸水平上均与其他国家的病毒株有着显著的差异。我国学者采华等对中国人感染的B19病毒DNA的VP1独特区基因序列进行分析，结果发现与国外报道的B19病毒Wi株基因序列相比较，有2处碱基不同，这会导致所编码氨基酸的改变，从而影响VP1蛋白免疫抗原表位，因此我国应针对本国的病毒株研制ELISA试剂盒。国内学者周铁群、于红等通过DNA重组技术，构建了B19病毒VP1独特区和VP1/VP2共同区主要抗原片段基因高效表达菌株，为研制和开发具有我国独立知识产权的B19病毒基因工程抗原ELISA诊断试剂盒提供了有价值的资料;但国内对非结构蛋白的检测及其致病性研究少有报道。已证实NS1蛋白最具抗原性的部分位于蛋白的羧基末端，它能刺激机体产生相应的抗体，本研究建立的B19非结构蛋白DNA巢式PCR检测方法，所用引物即来自该区域，这将为我国研制非结构蛋白的ELISA检测试剂盒提供新的思路。

八、抗原抗体检测

(一)抗体检测

诊断B19近期感染最敏感的试验是IgM抗体检测，PCR试剂盒系华美生物公司产品，大约90%的病人在症状出现后3天即可通过酶免疫试验检测到B19的IgM抗体，抗体的阳性率和滴度在发病后30～60天后开始下降。B19 IgG抗体通常在发病后7天出现，持续数年。

为改善B19感染的诊断并鉴别原发和继发感染，Soderlund等建立了以不同重组抗原为基础的蛋白-变性IgG亲和力EIAs。结果显示，以VP1蛋白抗原为基础的IgG亲和力测定试验高度特异敏感，适于B19近期和原发感染的鉴别。

急性期感染以低亲和力抗体为主，随感染后时间的推移，抗体成熟，亲和力增高。对于近期B19感染，抗体亲和力试验比IgM检测更敏感、更方便。IgM通常持续2～3个月，低亲和力IgG抗体持续1～2个月。IgG亲和试验与传统的血清学诊断方法一起使用，将改善B19再次感染的诊断并能监测在高危情况下如溶血性疾病或孕期时的感染情况。进而，在有症状病人或有与B19病因学诊断一致发现时(如DNA或IgM阳性)，该试验能鉴别急性和慢性感染。蛋白-变性免疫试验是一个新技术，测定IgG抗体的抗原亲和力(功能亲和力)，以逐渐增加的IgG结合力作为抗体反应成熟的指标，可区分近期原发感染和既往感染，包括再次感染、内源再次激活或外源再次感染。

(二)抗原和DNA检测

采用巢式聚合酶链反应(PCR)技术进行病例对照研究，儿童中对B19的IgM免疫应答有个很特别的现象。在有出疹(传染性红斑)的成人中B19-IgM反应非常强，但在有同样临床症状的儿童(＜13岁)中却很弱。然而当患有溶血性贫血的该年龄组儿童感染B19病毒并发生再生障碍危象时，IgM反应特强。因此，尽管在成人依靠IgM诊断是可靠的，但在儿童中，只有在特殊情况下才可依靠IgM反应进行诊断，这些IgM反应不同的原因可能与B19病毒血症的强度有关。因此，IgM检测对于儿童急性感染的诊断可能并不是一个可靠的手段。此外，免疫抑制也可使B19抗体丢失，以及再次出现病毒血症。因此在免疫缺陷病人的慢性B19感染诊断，可能检测不到B19抗体，需进行B19DNA或病毒抗原的检测。

检测病毒最敏感的手段是核酸杂交。该试验被用于鉴别血清、白细胞、呼吸道分泌物、尿和组织标本中的B19DNA。由于在检测不出病毒血症的情况下，B19可在骨髓细胞中长期存在，原位杂交对于特定病毒核酸在细胞中的定位很有意义。Musiani等建立了原位杂交化学发光法，通过免疫酶反应检测骨髓细胞中的B19病毒DNA，结果特异、敏感性高于比色法原位杂交。该法仅需少量细胞即可诊断B19感染，而不必抽提病毒核酸，不需要B19感染的分子方面的资料，在研究和诊断上具有广泛的应用价值，对于监测慢性感染中B19在骨髓细胞中的持续复制很有意义。Gentilomi等建立了一个简便、快速的免疫过氧化物酶斑点试验，直接检测人血清中的B19衣壳抗原。只需将血清标本点到尼龙膜上，再用抗B19衣壳蛋白VP1和VP2的单抗，通过免疫过氧化物酶染色复合物，即可检测出该二抗原。试验可在4小时内完成。作者检测了541份血清标本，结果与斑点杂交和巢式聚合酶链反应(PCR)可比。其敏感性较斑点杂交法高，但较巢式PCR法稍低。由于该方法的敏感性水平适合急性B19感染的检测，以及从试验花费、时间和试验实用性考虑，作者认为该法特别适用于样品的大规模筛选，并可替代常规实验室评价B19感染时的DNA检测方法。

以往在献血员筛选中主要采用PCR方法，但该法检测出的阳性不能区分样本中的病毒体是否具有感染性，它可以检测出灭活的或变性的病毒。Sato等基于B19受体是红细胞P抗原的特性，建立了快速敏感的用于大规模筛选献血员B19的功能性的方法调节——B19病毒受体介导的血凝试验(RHA)，该法与PCR相比，简便、快速且经济实惠，其最高敏感度约为每毫升105～106个拷贝病毒基因组，按半定量PCR计算，比双向免疫扩散(DID)要敏感10 000到100 000倍，敏感性比PCR小100到1 000倍。但与PCR不同的是，RHA检测出的只是那些能与受体分子结合的(功能性的)病毒粒子。在检测献血员标本时，未发现任何PCR阳性而RHA阴性的样本。研究表明RHA对于检测有病毒血症的献血员，其敏感性和特异性是足够的。