附录三　常用的植物制片方法

在生物学教学或有关生物形态结构的实验研究中，都离不开用光学显微镜观察材料。而显微镜观察的材料必须首先能透光并安置在一定规格的载玻片上，也就是必须制作成玻片标本或称制片。玻片标本可以用各种方法来制作完成，如组织离析法、装片法、涂片法、压片法与切片法等，至于采取何种方法取决于看材料的性质和观察的目的而定。在生物学实验教学和科学研究中，玻片标本是很重要的材料。学会制作各种标本，对丰富教学实验内容以及科学研究都具有很重要的意义。

一、徒手切片法

将新鲜材料切成薄片，制成临时装片，操作步骤如下：

1.准备

首先检查本实验所需的仪器、用具、药品、材料是否齐备。然后擦洗载玻片和盖玻片，擦洗时应左手拇指与食指持玻片的边缘（注意不要用手指涂玻片表面），右手持纱布，将玻片夹于两层纱布之间，然后朝一个方向移动擦拭，注意用力均匀，将擦好的玻片放好备用。

2.切片

首先用解剖刀或双面刀片将直径为1cm的材料截取为长为2～3cm一段（切片的材料如为可直立的条状，可用刀片直接截取；如材料较软则需要夹持物辅助截取），用左手大拇指或食指夹住材料，并使材料的纵轴面与水平面相垂直。材料的上方高出于手指2～3mm，不宜太高，否则材料容易摇动。材料的下端可用中指顶住，切片时可将材料缓缓向上顶。右手以拇指和食指拿稳刀片，然后即可切片。切片时为了避免材料干枯，应使材料的切面和刀刃上保持有水，呈湿润状态。然后刀刃应以水平方向轻轻压住它，以均匀的力量和平稳的动作，从刀刃的右侧斜向左的方向切。切时要用臂力而不要用腕力，而且不要用力过大不可向内平平挤压材料，也不可从左右两方向来回切割材料。每切2～3片后，就把所切材料移入盛有清水的培养皿中，备用。如果切面倾斜，应立即纠正。否则由于细胞切面偏斜，影响观察。过于柔软的器官，例如幼嫩的叶片，难于直接拿在手中进行切片。切时需夹在坚硬的维持物中，以便于把握操作，维持物一般用胡萝卜根、马铃薯块茎，将要切的材料夹于其中，然后进行切片。切片后应尽量选择比较完整的切片进行装片观察。有时为了使植物组织不同部位细胞显得更为清晰，可把材料进行染色。

二、离析法

在观察植物器官内不同组织的细胞特征时，切片的方法往往不能得到单个细胞的立体形态，因此常采用离析的方法获得分散的细胞。离析法的原理是用一些化学药品配制离析液把细胞壁中的中层物质（果胶质）溶解，使细胞分离散开，便于观察。离析液的种类很多，常用的有铬酸-硝酸离析液，主要适用于木质化组织，如木材纤维等。其操作步骤是：先将材料洗净，用刀切成1～2mm宽的狭条（如叶片）或切成火柴棍粗细的长约1cm的小条（如根茎），切好的材料放进小玻璃瓶中，然后加入离析液，加入量约为材料的20倍，塞紧瓶塞放在30℃～40℃温箱中，浸渍时间因材料性质而异，一些叶片或幼嫩的根和茎，3～4h即可，而有些次生结构（如木质部）则需1～2d，如超过两天仍未离析，应更换离析液一次。检查材料是否离析，可先取出少许材料，放在载片上，加一滴水，盖上盖片，然后用小镊子末端在其上轻轻敲打，如果材料分离则表明浸渍时间已够。此后倒去离析液，用清水冲洗，即可制片观察，或放于50%或70%酒精中保存备用。

三、压片法

压片法是将植物的幼嫩器官如根尖、茎尖和幼叶等压碎在载玻片上的一种非切片制片法。这种方法比较简便，经染色后可作临时的观察标本，也可以经过脱水、透明等手续制成永久的制片。在观察植物细胞的有丝分裂、植物细胞遗传学等方面的研究中应用极为普遍，特别在染色体数目的检查方面，此法尤为重要。压片法的实验步骤包括：取材→预处理→固定→解离→染色→压片→镜检和封固等。

1.取材

用锋利的双面刀片截取生长良好的植物根尖或茎尖，长度为2～3mm。

2.预处理

将材料放入8-羟基喹琳或对二氯苯等预处理液中进行预处理，使细胞分裂停留在有丝分裂的中期，并使染色体缩短变粗。预处理的时间视不同植物而定，一般洋葱根尖用对二氯苯预处理液处理4～5h。

3.固定

一般采用卡诺固定剂进行固定，固定时间通常为2～24h，以低温固定效果较好。材料经固定后，如不立即进行压片，可保存在70%的酒精中，置于冰箱内长期保存。

4.解离

用酶或盐酸处理固定后的材料，使细胞分离，便于压片。一般是将固定后的材料在50%酒精中浸泡5min，再入蒸馏水洗涤5min后，转入浓度为lmol/L的盐酸溶液中，置于60℃恒温水浴锅中解离，解离时间一般2～8min，时间太短，细胞不易分离，时间过长，则染色体染色浅或不着色。

5.染色

常用品红（即石炭酸-碱性品红）或醋酸洋红等核染色剂进行染色。

6.压片

将材料放在干净的载玻片上，盖上盖玻片，用解剖针或铅笔轻轻敲击盖玻片，使细胞分离散开并压平。

7.镜检

将压片置于显微镜下观察，选取染色全体分散、清晰的细胞，用记号笔在载玻片和盖玻片上分别作记号。

四、涂布法

涂布法与压片法类似，但材料不必水解离析，适用于花粉和花粉母细胞等疏松组织，可以均匀地涂布在载玻片上，是另一种重要的不用刀切片的制片法，广泛应用于花粉粒的发育、染色体数目的检查和染色体的教学与科研中。其制片方法主要分为以下三个步骤：

1.取材与固定

预先采集花药，经过药液的固定，把它们贮存起来，作实验时就不会受到季节的限制。如需要制作花粉母细胞减数分裂全过程的制片，就必须采集幼嫩的呈绿色的花药较为适宜。由于不同植物的花期不同，具体的采集时间也不一样。至于观察减数分裂的具体的取材时间，因其亦有昼夜的节律性，一般于清晨6～7时和下午4～5时取材，均可以完成实验任务。一般小型花朵采集后，可将幼嫩小花甚至整个花序固定于卡诺固定液中，大型花朵可以仅固定雄蕊的花药，经过2～24h后，逐级换入95%酒精和85%酒精浸洗，再转入70%酒精中保存。注意必须洗净固定液中的醋酸，以免材料受腐蚀。若有条件，可将固定的材料保存在4℃的冰箱中，能数年不坏，随用随取，十分方便。

2.染色与涂布

取已经固定好的材料转入50%酒精，经蒸馏水清洗后，取出一个花药置清洁的载玻片上，加一小滴改良的苯酚品红染色液，用刀片切去花药的一端，用镊子夹着花药，将其切面放在载玻片上涂抹；或用刀片在花药中部横断为二，再用解剖针从花药的两端向中部断开处压挤，使花粉母细胞散出，并涂布成一薄层（注意去掉花药壁的残渣），再滴一滴45%醋酸使之软化与分色；盖上盖玻片，用橡皮头轻压盖玻片，使花粉母细胞均匀散开即可观察。此法染色效果很好，核和染色体均被染成鲜艳的紫红色，细胞质无色或只有些淡粉色，而且这种染色剂的染色性能牢固，操作简便，与过去使用的醋酸洋红液等染色剂相比，有许多优越的地方，是近年来研究出的一种很有价值的核染色剂。