第二节 肿瘤基因

一、肿瘤基因

当细胞的生长与分化失去了控制即形成了肿瘤。现已发现近100个肿瘤相关基因（cancer－causing gene），或简称肿瘤基因（cancer gene），它们编码了参与调节细胞生长与分化的关键蛋白。关于这些蛋白在细胞的生长与分化中的功能及其交互作用的研究越来越深入，也奠定了肿瘤发生机制研究的基础（图13－3）。这些基因首先编码了调节（其他）细胞生长与分化的生长因子（growth factor），如血小板源生长因子（platelet－derived growth factor，PDGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）；生长因子与细胞表面的生长因子受体（growth factor receptor）特异结合，启动细胞内的信号转导（signal transduction）过程，包括激活一些蛋白激酶（protein kinase），如src酪氨酸激酶（src tyrosine kinase）、丝裂素活化蛋白（mitogen－activated protein kinase，MAPK）和Jun K等；激酶通过调控靶蛋白，调节细胞的生长与分化相关基因的表达，进一步调节细胞的行为。

上述过程中任何一个编码关键蛋白基因的突变会影响到细胞某一进程，而突变的不断积累（一系列的基因突变）将使细胞克隆脱离正常细胞群体形成肿瘤，这也就是所谓的肿瘤发生的多次打击（multi－hit concept of carcinogenesis）。结肠癌的发生进程是这一假说的例证之一。

二、肿瘤基因的主要类型

一般肿瘤基因分为3种类型：抑制细胞增殖的肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG）、促进细胞增殖的肿瘤癌基因（oncogene，onc）和参与DNA修复的基因（表13－1）。

（一）TSG

家族性视网膜母细胞瘤基因（RB1基因）是第1个被确定的TSG。这是一类控制细胞分裂、防止肿瘤形成的基因。TSG的作用特征是，经遗传的肿瘤抑制基因突变在个体水平是显性的（即杂合子可发展为肿瘤），但在细胞水平则往往是隐性的（即杂合子并不发展成肿瘤）。

Knudson用二次突变假说（two－hit hypothesis）来解释这一现象。同时也解释了视网膜母细胞瘤的家族性（早发）与散发性（晚发）这一临床现象。二次突变假说认为，家族性视网膜母细胞瘤家族连续传递时，已经携带了1个生殖细胞系（germline）的突变，此时若在体细胞（如视网膜细胞）内再发生1次体细胞突变，即产生肿瘤。这种事件较易发生，所以患者发病年龄较早；而散发性的视网膜母细胞瘤是由于1个细胞内的2次体细胞突变而产生的，发生率较低或不易发生，所以患者发病年龄一般较晚（图13－4）。

TSG所编码蛋白的总的功能是通过调控细胞周期，防止异常增殖的细胞转变为肿瘤。如RB1所编码的蛋白p RB有两种状态，一种是磷酸化程度高的p RB（失活状态），另一种是磷酸化程度低的p RB（活化状态）。这是由细胞周期蛋白（cyclin）／CDK所调控的。磷酸化程度低的p RB与E2F相结合，磷酸化程度高的p RB与E2F相分离；E2F被激活，而E2F的激活是细胞进入S期所必需的。所以p RB可以使细胞周期过程终止。RB1功能缺失型突变（如基因缺失或5′高甲基化），可以使p RB功能缺失，失去对细胞周期的控制，导致肿瘤发生。

1.RB1基因 视网膜母细胞瘤是婴儿视网膜发生的恶性肿瘤，发病率约1／20 000个活婴。大约40％的视网膜母细胞瘤是遗传性的，子代通过生殖细胞遗传1个突变的RB1基因。如果在1个视网膜细胞中发生1次体细胞突变，剩下的另一个正常等位基因失活则可产生肿瘤。患病的幼童大多双眼均受累，家族性视网膜母细胞瘤往往表现为显性遗传及外显不全。另有约60％的视网膜母细胞瘤是散发性的，这些病例的视网膜母细胞，往往1个细胞中的2个RB1等位基因因体细胞突变而失活。由于这种情况的发生比较稀有，所以往往发病时只表现为单侧肿瘤，而且比家族性视网膜母细胞瘤发病年龄要晚。

RB1基因已定位于13q14.1－q14.2，全长约200kb，有27个外显子，基因编码924个氨基酸残基的核磷蛋白（p110RB11），相对分子质量为110kb。RB1基因编码的蛋白调控着细胞的分裂与增殖，它可结合于E2F蛋白并使其失活，而E2F蛋白属一种转录因子。它是细胞分裂由G1期到S期的一个必要蛋白质。RB1基因不仅在视网膜细胞中表达，也在其他组织中有表达。

2.p53 p53和RB1都是一类细胞周期的调控因子。它们使细胞维持在静止期甚至使细胞产生自杀作用，除非有合适的条件使细胞进入周期过程。p53的功能形式为1个四聚体，p53基因座上的2个等位基因均参与编码四聚体中的亚基，1个p53等位基因的突变可以使整个p53的活性丧失，p53的基因突变就表现为“显性负突变（dominant negatives）”的特征。相反， RB1蛋白为1个单聚体，RB1座位上1个等位基因的突变几乎不产生什么影响，即RB1的突变对野生型来说是隐性的，这就与呈显性的癌基因和p53基因的显性失活突变完全不同。与RB1基因类似，多数TSG对野生型来讲是隐性的。

p53基因定位于17p13.1，其编码的蛋白质含375个氨基酸残基，N端73个氨基酸残基为调控活性区域，其中含与mdm－2细胞周期蛋白结合的区域。p53基因受mdm－2基因编码蛋白的调控，缺失p53功能的肿瘤组织有高表达的mdm－2基因。另外还有一些与p53相关的基因在人类肿瘤细胞中也发生突变，Cipl蛋白的合成受p53的控制，肿瘤组织也发现它的突变，p16基因也有突变发生。所以许多人类肿瘤有控制细胞周期（即起负调节作用）的基因的突变，如RB1、p53、mdm－2、Cipl、p16和cyclin D。因此，细胞周期控制因子的失活对肿瘤的发生是很重要的。

3.杂合性丢失 RB1基因被定位于13q14.1－q14.2，某些视网膜母细胞瘤患者遗传性的突变就是由于此区域的缺失或易位。通过对RB1与家族性视网膜母细胞瘤患者基因座附近DNA多态性的研究发现，这些患者其他组织或正常组织细胞中许多基因座是杂合的，但相同的基因座在肿瘤组织中却是纯合的，所以肿瘤组织中的DNA样品只含有1对13号同源染色体中1条染色体上的等位基因，表现出杂合性丢失（loss of heterozygosity，LOH）或缺陷基因的完全表现。在家族性视网膜母细胞瘤中，这个缺陷的或获得保留的异常13号染色体往往从其患病的双亲中遗传而来。单个等位基因的缺失可以产生杂合性丢失，减数分裂时的重组或交换及染色体不分离也是产生杂合性丢失的可能原因。微卫星DNA或短串重复（STR）DNA多态性现象方便了对杂合性丢失的研究并用于基因诊断。1992年， Weissenbach等以STR为标记的第2代连锁图取代了限制性（内切酶）片段长度多态性（RFLP）的人类基因组连锁图。STR呈孟德尔式遗传及有很高的杂合度，在基因诊断中很有价值。对于TSG，可以利用其附近的连锁的微卫星DNA多态标记检测杂合性丢失情况。杂合性丢失在Wilms瘤等许多肿瘤中均有发现，包括遗传性和散发性肿瘤。杂合性丢失的发生同时也暗示了旁边可能存在1个TSG，从而可以进行新的TSG的研究。

（二）癌基因

癌基因通俗地说就是肿瘤基因（cancer gene），从功能上来说它们和TSG在肿瘤的发生中起相反的作用（表13－2）。

癌基因是一类影响正常细胞生长和发育的基因。如果癌基因发生改变或过量表达，就会引起细胞失控性生长，最终转为恶性。许多癌基因是由正常的原癌基因（proto－oncogene， pro－onc）突变而来。原癌基因是一类控制细胞增殖与分化的基因。目前已经确定了数十种人类癌基因（家族），包括与之对应的正常的原癌基因（表13－3）。

许多已定性的人类癌基因与从致瘤的RNA病毒中分离出的病毒癌基因（viral oncogene，v－onc）有关联。从病毒中分离出的遗传物质可以使正常细胞发生转化而恶变，因而基因在肿瘤的发生中起关键作用。一类称为反转录病毒（retrovirus）的RNA病毒在反转录酶（reverse transcriptase）的作用下可将RNA反转录为DNA，这种病毒DNA可以整合（integrate）到作为宿主的人的染色体DNA中进行表达。当从Rous肉瘤病毒中得到src癌基因时发现，src癌基因并不是真正的病毒基因，而是由一个祖先的病毒经转导（transduction）而携带出的宿主基因，这个相应的宿主基因就是第1个被发现的原癌基因。相对于病毒癌基因，细胞中正常的原癌基因又被称为细胞癌基因（cell oncogene，c－onc）。后来发现许多原癌基因都有其相应的RNA肿瘤病毒。DNA肿瘤病毒（如SV40和多形瘤病毒）的癌基因，不是从原癌基因转导而来，而是病毒本身的基因。原癌基因在进化上有高度的保守性。例如，原癌基因H－ras和其对应的蛋白质在酵母和人等生物体中均有发现，表明其蛋白对维持基本的生命活动是必不可少的。原癌基因的蛋白产物在信号转导和细胞生长的调控方面起重要作用，当这些调节或转导发生改变时，细胞即可能发生恶性转化。

（三）原癌基因的激活

1.基因突变 早期的一个重要发现是对从膀胱癌细胞系的ras癌基因的分析得来的：癌基因与对应的原癌基因仅有一个碱基的差异，即第12位密码子GGC突变为GTC，使甘氨酸变为缬氨酸，这种肿瘤体细胞中的点突变产生了能刺激细胞发生转化的异常蛋白。癌基因在细胞水平呈显性，一个等位基因的突变足以使正常细胞发生恶变。Ras蛋白是一种位于细胞膜内部，存在于细胞膜上的信号转导蛋白。当它被细胞外因子激活时，便会从GDP状态变为有活性的GTP状态，产生刺激细胞生长的信号。而突变的Ras蛋白始终处于被激活的GTP活性状态。现已在许多肿瘤中发现了ras基因的点突变。

2.染色体易位 结构性突变仅仅是可诱导原癌基因活性的几种机制之一。表13－4列出了原癌基因激活的几种机制。染色体易位在许多癌变中是原癌基因激活的普遍机制。

在慢性粒细胞白血病（CML）中，可在造血干细胞中观察到9号染色体与22号染色体的易位，结果22号染色体上的裂点簇区（breakpoint cluster region，BCR）基因易位到9号染色体原癌基因abl处。BCR DNA序列与abl序列相连编码形成一个嵌合蛋白，它比正常的abl蛋白要长，但酪氨酸激酶活性增强。尽管正常abl蛋白与BCR蛋白的功能还不清楚，但嵌合蛋白被认为改变了恶性造血细胞中abl正常蛋白的功能和表达。用反转录病毒载体构建的BCR－abl融合基因导入正常鼠的骨髓中，结果实验鼠发生了血细胞癌，其中也包括CML，这个结果表明Ph染色体的这种易位可能是引起癌变的原因。

在Burkitt淋巴瘤的t（8；14）易位中，c－myc癌基因由8号染色体易位到14号染色体的Ig重链基因附近，易位使c－myc置于Ig H链基因活跃的启动子控制之下。因而易位的c－myc基因转录活性明显增高，增多的myc蛋白使一些控制生长的基因活化，最终导致细胞恶变。

细胞遗传学上的变化为肿瘤的标记，并且晚期肿瘤或更恶性化的肿瘤及浸润阶段的肿瘤比早期肿瘤更常见。许多肿瘤发生方面的细胞遗传学研究来自白血病，研究的焦点在于这些异常的细胞遗传学及分子基础，现在看来其中的许多异常涉及原癌基因，并且可能激活了原癌基因的表达。

3.基因扩增 在肿瘤细胞尤其是神经系统肿瘤中经常可以看到基因扩增（gene amplification）现象。扩增的DNA片段在细胞遗传学上往往以两种方式存在且可以检测到，即均染区（homogeneously staining region，HSR）和双微体（double minutes）。前者是在染色体的某一位置上可以看到的串联扩增现象，后者则是一个独立存在的小染色体。在神经母细胞瘤的染色体显带中，可以看到一个比正常染色体加长的不显带的均匀染色区。均染区及双微体是如何及为何产生的目前还不太清楚。研究发现，被扩增的区域包括原癌基因的过量拷贝，如在40％的神经母细胞瘤细胞中，N－myc原癌基因被扩增了200倍以上。这种基因扩增被认为可产生原癌基因的过量表达。