五、疱疹病毒检测

生殖器疱疹（genital herpes）的病原体是单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）。HSV有两个血清型，即HSV -I和HSV -2，大多数的生殖器疱疹是由HSV-2引起的。生殖器疱疹的实验室检测包括病毒分离、细胞学检查、单纯疱疹病毒抗原检查和血清学检测。其中病毒分离和鉴定可作为确诊，其他方法的诊断价值有限。

（一）单纯疱疹病毒的分离和鉴定

1．标本的收集

（1）疱液：用结核菌素注射器从成熟的小疮中抽取液体，注入有2．0ml病毒运送液的小瓶中（每ml含100mg庆大霉素和10mg两性霉素B的0．5%牛血清白蛋白Hanks平衡盐水）。也可只刺破小疮后用无菌棉拭取材，并将棉拭头剪断放入2．0ml病毒运送液的小瓶中。

（2）溃疡：先将表面物质去除，再用灭菌棉拭用力擦拭或刮取溃疡的基底部，并将棉拭头剪入2．0ml病毒运送培养液中。

如果使用藻酸钙拭子，则它不应保留在培养基中，因藻酸钙对病毒有毒性，而应将标本洗于培养液中而将拭子丢弃。

2．试验方法 虽然标本可以冷冻，但在收集24～48h内就接种较为有利。所用细胞为原代人胚肾细胞、人胚肺成纤维细胞、HeLa细胞、Vero细胞和HEP -2培养物。标本在送达实验之后先将病毒输送液摇匀，取2．0ml处理过的标本接种于细胞培养基中，放在37℃孵箱中培养。每日观察有无出现病毒对细胞的致病作用。典型的病变可在24h或几天内出现，取决于接种液中病毒的含量和毒力。

3．疱疹病毒的鉴定 常用免疫荧光法，方法如下。

（1）如细胞出现典型的病变时，可初步报告为“单纯疱疹病毒分离可疑”。

（2）在至少50%人胚肾细胞出现疱疹病毒的病变之后，将培养物反复冻融3次，吸取0．2ml接种到新的HEP-2细胞管中。这种细胞至少有50%能产生病变，因而适合于做免疫荧光试验。

（3）再经培养后，将HEP-2细胞用吸管吹打下来，以200g离心10min使沉淀，去上清后，将细胞混悬到100μl pH7．2的磷酸缓冲液（PBS）中。

（4）取25μl的细胞悬液滴到载玻片两端标记好的位置上。

（5）每个涂点用小棒涂成直径为1cm的圆膜，经空气干燥后用丙酮固定10min，再在空气中干燥。

（6）涂片用直接或间接荧光法染色。试剂可用商品化的结合荧光素的多克隆抗血清和特异性单克隆抗血清。

（7）一旦一个疱疹病毒完成了分型鉴定则可报告为“初步的疱疹病毒分离物已鉴定为Ⅱ型（或Ⅰ型）单纯疱疹病毒”。

（二）单纯疱疹病毒的细胞学检查

用灭菌棉试使劲擦试水疱或溃疡的基底，在载玻片两端作直径为1cm的2个圆膜。放在空气中干燥。用丙酮固定10min，待干。用荧光抗体与其结合。当检出特异的病毒感染细胞时，涂片报告为“免疫荧光法检查单纯疱疹病毒阳性”。细胞也可以用Wright或Giemsa及PaPanicolaou法染色，用光学显微镜观察，在多核巨细胞的胞核内找到嗜伊红包涵体有助诊断。但此法敏感性仅50%～80%，且不具有特异性。阳性结果常在病初和从水疱或小脓疱损害中获得，从溃疡性损害或从多次发作的病人取材时阳性率低，而恢复期损害（结痂的）中，病毒的发现率更低。

（三）单纯疱疹病毒抗原检查

近年来，直接检查临床标本的单纯疱疹病毒（HSV）抗原的诊断方法发展较快，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光法（IFA）、乳胶凝集（LA）等。DNA杂交与PCR检测技术也已在我国应用。这些方法有快速、特异、敏感及无损害性等优点。因此，HSV抗原直接检测是今后HSV检测的发展方向。

1．酶联免疫吸附测定（ELISA） ELISA由于具有方法简单、灵敏和特异性高等优点，已经在许多领域得到应用。一般认为此法的标本检出率在52．5%～96．1%。试验的原理是用特异性抗体致敏载体，与含有抗原的溶液共同孵育，洗去过量的抗原，再加入酶标记的特异性抗体。孵育后，洗去过量的酶-抗体结合物，然后加入酶底物，底物颜色的改变与抗原量呈正比。ELISA法又分为间接法、双抗体夹心法和竞争法。

2．免疫荧光法（IFA） 先将异硫氰基荧光素（FITC）和罗丹明等荧光素与特异性抗体结合，在一定条件下，再与标本中的相应抗原产生结合反应，形成有荧光的抗体-抗原复合物，通过荧光显微镜观察，可看到复合物发出的荧光，即表示标本中存在相应的抗原。

3．DNA杂交 核酸分子杂交技术以其特异和敏感为主要特点。目前，核酸分子杂交技术已经成为病毒基因工程领域中的主要研究手段之一，它被广泛应用于研究和临床工作。

试验原理是各种生物的DNA中碱基对是互补的，在适当的条件下，互补的单链DNA能形成双链结构。反应体系中如果以放射性核素或生物素标记的DNA作为探针，它与待检核酸中的相同序列可形成双链结构，通过放射自显影或免疫手段可检查待检核酸中的共同序列。但该方法试验条件要求较高、费时、费事，且标记放射性核素不仅有损害性，也不易保存，使常规使用受到限制。

4．聚合酶链反应（PCR） 聚合酶链反应是20世纪80年代中期迅速发展起来的高生物技术，也是基因扩增技术的一次重大革命。此项新技术被广泛应用于分子生物学、医学及遗传学等各个领域。

利用DNA聚合酶依赖DNA模板的特性，模仿体内的DNA复制过程。在附加的一对引物之间诱发聚合反应，经过DNA变性、退火、延伸三大步骤的多次循环，可以得到大量介于这对引物之间的序列，用电泳或核酸杂交技术进行检测。PCR技术具有敏感、特异、快速等特点。

PCR作为一种新型诊断方法，特别是它的灵敏性高，可检测到小至3pfu HSV。PCR的敏感性较细胞培养高，已初步在临床病毒检验工作中显示出了较大的优越性。但该方法由于高灵敏度，易产生污染而导致假阳性。对实验室设置要有3～4个各自封闭的工作区间，室内用品严格专用及一次性使用，实验过程要有严格的质检和内对照等；工作人员素质要求高，对临床标本的采集和处理要求也高，否则都会影响结果的准确性。目前市售的国产试剂盒，在质量上是有一定差异的，在选择时，一定要选用质量可靠的试剂盒，否则会影响结果的可靠性。

一般认为PCR基因扩增技术和DNA杂交技术不能单独作为确证指标，只有在PCR扩增和DNA杂交阳性并且检出该病原体相应的抗体时才能作出病原学诊断。目前，检测HSV病原体技术主要采用酶联免疫技术（ELISA）。它具有敏感度高、特异性强、准确率高、应用面广、不需高档实验仪器和操作简便等优点。

（四）单纯疱疾病毒的血清学检测

血清学诊断目前常用的是中和试验。它可用于诊断单纯疱疹病毒的原发感染，但对恢复期或复发的生殖器疱疹的诊断没有用处。

中和试验是指特异性抗体能中和相应的病毒活力（或细菌外毒素）的一种特异的抗原抗体反应。自从能用组织培养和鸡胚来代替动物做中和试验之后，该法已变得较为简便和实用。