二、淋球菌检测

淋病（gonorrhea）的病原体是淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae），又称淋病双球菌，简称淋球菌或淋菌。淋球菌无鞭毛，无芽胞，无荚膜，容易侵犯人类泌尿生殖道的柱状上皮细胞。与淋球菌同属的有脑膜炎球菌、黏膜炎球菌和黄色球菌等，它们多寄居于人的鼻咽腔，在形态上和淋球菌相似，在检测时应该加以鉴别。

（一）标本的采集和运送

在取材作涂片时，应先用灭菌等渗盐水洗净尿道口，然后用手指由后向前挤出脓液，用棉拭子或白金耳蘸取脓液轻轻涂在载玻片上，待自然干燥后作染色。如从男性病人前尿道取材作培养，应用白金耳或棉拭子深入尿道2～4cm，取出的分泌物应略带黏膜。从女性病人的宫颈取材时，应将棉拭子插入宫颈口1．5cm，稍转动并停留10～30s，让棉拭子充分吸附分泌物。从肛门取材时，应将棉拭子插入肛门2．5cm以上，从紧靠肛环边的隐窝中取材。检查淋球菌性咽炎时应从扁桃体或扁桃体窝或咽后壁取材。取材的拭子应对病原体的生活力无影响，可用棉拭子或藻酸钙拭子。此外，从女性病人宫颈取材时，应用灭菌盐水湿润窥器，而不要用润滑油等以防止抑制淋球菌生长，拭子插入宫颈管前，应先将堆在宫颈口的分泌物揩去，以免过多杂菌干扰淋球菌的生长；取出拭子时不要碰到阴道壁，标本离体后应立即接种到培养基上。如取材处离实验室较远，应将标本放在合适的运送培养基中。

（二）检测方法

1．分泌物的徐片检查 急性淋球菌性尿道炎病人常有大量黄色脓性分泌物。在有些脓细胞内可有许多淋球菌。淋球菌革兰染色呈阴性反应，具有特殊的菌体形态。因此，取病人尿道分泌物制成涂片作革兰染色，检查有无典型细胞内革兰阴性双球菌，可作初步诊断的依据。

（1）方法：先用灭菌拭子揩洗尿道口，然后用手指由后向前挤出脓液，蘸取脓液后轻轻涂于载玻片上。待自然干燥后加热固定，染色，镜检。

（2）结果：在急性病人的尿道脓性分泌物革兰染色涂片中，常可见到大量红色多形核白细胞。在有些细胞中吞噬有淋球菌。淋球菌为革兰阴性，呈卵圆形或圆形，常成对排列，接触面扁平或稍凹。菌体长约0．7μm、宽约0．5μm。但两菌大小可有差异。多数多形核细胞中并不含淋球菌，但不少脓细胞中常含有1至数对，甚至20～30对淋球菌，淋球菌通常存在于细胞质内。

在病期较长的淋病病人的徐片中淋球菌比较少，有时呈单个、四联和八叠状，且常位于细胞外。对有些菌有时难以下结论，需要进行培养和鉴定。

（3）注意事项

1）涂片时不要用力涂擦，应将棉拭子在玻片上轻轻滚动。由于急性病人诊断标准为见到“细胞内革兰阴性双球菌”。所以徐擦过劲，细胞破裂或变形，细菌从细胞内逸出，会造成诊断上的混淆。

2）涂片厚薄要合适。涂片过厚，加上染色过程中脱色时间不足，革兰阴性菌会呈现紫色而成了阳性菌。因此，脱色时间要视涂片厚薄而定。在大量染片时，最好用一已知的革兰阳性菌（如葡萄球菌）和阴性菌（如大肠埃希菌）作对照，以免造成结果错误。

3）固定涂片，只需将徐片迅速通过火焰2～3次，避免加热过度使细胞变形扭曲。当把加热的片放到手背上时应不感到太烫为宜。

4）涂片检查方法简便，价格低廉。对有症状的男性病人，敏感性和特异性均在95%以上，徐片检查对这类病人的诊断是很好的方法；但涂片检查对女性宫颈标本，敏感性仅40%～60%。特异性从80%～90%不等。因女性宫颈分泌物中杂菌很多，有的菌如不动杆菌在形态上很像淋球菌。因此，WHO不推荐用徐片法来检查女性病人。可是当典型革兰阴性细胞内双球菌被训练有素的检验人员在宫颈分泌物徐片中找到时，也可作出初步诊断并进行治疗。但仅用涂片检查女性病人时，会有不少病人被漏诊。

5）不推荐用涂片检查来诊断淋球菌性直肠和咽部的感染，也不推荐用来作判愈。

2．淋球菌的分离培养 如果标本中有淋球菌，则在合适的培养基上经培养后可长成菌落。各种细菌在培养基上生长成的菌落形态各不相同。根据菌落的大小、表面高起或扁平、光泽、色素和边缘的情况等，作为细菌鉴定的标准。

（1）培养基：由于淋球菌的营养要求较复杂，所用的培养基中应含有动物蛋白及细菌生长所需的各种因子。目前国内常用的是血液琼脂或巧克力琼脂。为抑制杂菌，在培养基中可加入少量抗菌物质如多黏菌素B（25μg／ml）和万古霉素（3．3μg／ml）等。所用血液如羊血、兔血和人血均可，浓度为8%～10%。但避免血液中加入抗凝剂等药物。培养基的pH以7．4为好。目前，国外常用的培养基有Thayer－Martin（T－M）培养基、New York City（NYC）培养基和Martin－Lewis（ML）培养基等。T－M培养基是在GC基础培养基中，加入血红蛋白（1%）、抗生素（万古霉素3μg／ml、黏菌素7．5μg／ml和制霉菌素12．5μg／ml）和淋球菌增菌剂，使绝大多数杂菌被抑制而淋球菌菌落长得较大，在平皿中几乎呈纯培养，从而大大提高了由子宫颈、尿道，尤其是咽和直肠部位分离出淋球菌的阳性率。

（2）培养条件：淋球菌对外环境变化颇为敏感，对寒冷和干燥抵抗力很弱。因此，为了保证培养有足够的成功率，取材后应立即接种，标本离体时间越短越好。取材处离实验室距离较远时，应将标本接种于Stuart或Amies运送培养基或1%葡萄糖肉浸液中，并注意在运送过程中保温。接种的血平皿应先放在37℃温箱中预温。

培养的最适温度为35～36℃，＞38．5℃或＜30℃便生长不良。因此，孵育的温度要恒定。

淋球菌为需氧菌，但最初从人体分离时动促进其生长，需用5%二氧化碳环境培养。为保持一定的相对湿度，可在培养缸中放些浸水棉球。

（3）培养结果：淋球菌在血平皿上经24～48h的培养后，可形成圆形、凸起、湿润、光滑、半透明或灰白色菌落。边缘呈花瓣状，直径为0．5～1．0mm，用白金耳触之有黏性。如继续培养，菌落面积增大，表面变得粗糙，边缘出现皱缩。若从菌落上取材作徐片，可见到菌的大小及染色的深度有差异用排列也不一致，约有25%的菌为典型的双球菌，其他75%为单球菌、四联形或八叠形。

据报道，把淋球菌培养在控制的条件下可见到4种形态的菌落，分别为T1、T2、T3、T4。T1和T2是从新采集的标本中分离出来的并与感染力有关，而T3和T4不能感染人。

淋球菌在液体培养基中生长于液体表面，或稍有轻度混浊和颗粒沉淀。

（4）注意事项

1）培养要获得成功，取材的部位和方法一定要准确。

2）对症状不典型的男性病人取材，最好是在晨起排尿前或排尿后2～3h之后。

3）对女性病人的检查主张用淋球菌培养。国内目前使用的血液琼脂或巧克力琼脂中加人多黏菌素和万古霉素以分别抑制革兰阴性和革兰阳性杂菌。但由于部分淋球菌（某些地区可高达5%）对万古霉素也敏感，因此，最好不用万古霉素。

4）淋球菌在血平皿上培养24h，菌落形态很小，肉眼难以辨认其特点。24～36h，菌落迅速长大。所以观看菌落特征最好在36h左右。超过36h，菌落特征也会有较大的改变。

（三）初步鉴定试验

1．革兰染色 淋球菌有特定形态。用白金耳从培养基上挑取可疑菌落在玻片上制成盐水涂片，经革兰染色，若见到具有淋球菌特征形态的双球菌，可做出初步诊断。

在载玻片上加盐水1滴，取可疑菌落制成涂片，干燥固定后作革兰染色。镜下可见革兰阴性球菌。菌体为0．7μm×0．5μm大小，呈肾形或卵圆形。约1／4为双球菌，多数为单球菌，个别呈四联或八叠状。与分泌物涂片所见不同，此徐片中无白细胞。

2．氧化酶试验 淋球菌在生长过程中产生氧化酶。往培养基上生长了24～48h的菌落上加氧化酶试剂（0．5%～1%新配制的盐酸四甲基对苯二胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液），淋球菌菌落的颜色可变成红紫乃至黑色。其反应式如下：

（1）方法与结果：①在混有杂菌的淋球菌分离平皿上滴加氧化酶试剂后变成紫红色的菌落为氧化酶试验阳性。②也可先挑取可疑菌落涂于一干滤纸条上，滴加试剂，涂菌处变成红色者为阳性。③或先滴一滴试剂于滤纸条上（勿太湿），再涂菌落，观察颜色变化，变成红色者为阳性。

（2）注意事项

1）为了保证有良好的反应，所用氧化酶试剂不应过分陈旧。正常的氧化酶试剂（盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺）应为淡红色。如果试剂买来时已成灰色或黑色，说明已失效而不应使用。试剂溶液配好后应放在棕色玻璃瓶中避光保存可使用1周。

2）氧化酶试剂遇铁也会出现红色而造成假阳性，所以操作用的接种环应避免用旧铁丝或电炉丝等制成，并在每次试验前先检查是否未挑菌的接种环接触试剂就有红色出现。

3）盐酸四甲基对苯二胺比盐酸二甲基对苯二胺敏感，将一滴盐酸四甲基对苯二胺溶液滴在菌落上，如菌落很快变为深紫色并保留0．5min以上则为阳性。

4）如需保留菌种，在菌落未完全变黑时可挑少许转种。菌落一旦变黑，多数菌即告死亡。

（四）鉴定试验

糖发酵试验：用作糖发酵试验的培养基中除供淋球菌生长所需的营养物质之外，还加有各种糖类和指示剂。淋球菌有分解葡萄糖的酶类，当它分解葡萄糖时产酸，使培养基的pH降低。因此，培养基中的指示剂颜色改变，如酚红由红变黄，溴甲酚紫由紫变黄。

几种奈瑟菌的糖发酵反应情况可见表4-1。

表4-1　几种奈瑟菌的糖发酵反应情况

（五）淋球菌对药物敏感性测定方法

当前，由于不规则用药和细菌变异的结果，我国已出现淋球菌的耐药菌株。检测淋球菌对抗生素的敏感性可用来检测是否产生了耐药株及其比率，为修订淋病治疗方案和对策提供重要流行病学资料。

测定淋球菌对药物的敏感性的方法很多，常用的有以下几种。

1．纸片扩散法 将含药纸片贴到涂有淋球菌的培养基上，药物即扩散到琼脂中。如果淋球菌对此药物敏感，则生长被抑制，在纸片周围形成一个透明的抑菌圈。琼脂中药物浓度与纸片距离成反比，距纸片越远药物浓度越小。因而，可根据抑菌圈的大小判定细菌对该药的敏感程度。

检查平皿并测量抑菌圈直径。参照标准报告结果。

2．琼脂稀释法 将待检菌株种于含有不同抗菌药物的琼脂平皿上，药物浓度小时细菌生长，药物浓度高时细菌生长被抑制，据此可测出药物对该菌的最小抑菌浓度，依标准判定菌是否为耐药菌株。

淋球菌对药物的敏感度是指淋球菌不生长的药物最高稀释度。常用μg／ml或mg／L表示。此数值也即该药对此菌的最小抑菌浓度（MIC）。

3．产青霉素酶淋球菌菌株（PPNG）测定——青霉素琼脂法 某些淋球菌菌株获得耐药质粒后产生β-内酰胺酶。该酶能分解青霉素，使培养基的pH降低，培养基颜色发生改变。产酶菌株分解青霉素产生青霉酶噻唑酸使培养基pH降低，颜色由红变黄。