一、梅毒螺旋体及血清抗体检测

梅毒（syphilis）是由梅毒螺旋体（treponema pallidum）引起的一种慢性经典性病。梅毒螺旋体是一种小而纤细的螺旋体状微生物，长度为5～20μm，平均8～10μm，直径＜0．2μm，有6～12个螺旋，因其透明不易染色，故称为苍白螺旋体。

梅毒的实验室方法主要有病原体检查和梅毒血清学检查。

（一）病原体检查

目前常用的有暗视野显微镜检查、镀银染色显微镜检查、浓盐酸蒸汽显示法和免疫荧光染色检查。其中暗视野显微镜检查是对早期现症梅毒检测的最好方法。诊断一期梅毒、二期梅毒，可取病人损害的渗出物或淋巴结穿刺术得到组织液，在暗视野显微镜下观察螺旋体的特征性形态和运动方式；孕妇羊水作暗视野显微镜检查对先天梅毒具有诊断价值。

1．暗视野显微镜检查

（1）取材

1）皮肤黏膜损害的取材：首先准备好一张干净的载玻片加1滴等渗盐水，用生理盐水棉签（不能用消毒液）清洁病损，如有结痂可用消毒的钝刀片刮去，要避免出血，轻轻挤压至出现渗液，用盖玻片蘸取少许渗出液，盖于先准备好的载玻片上，暗视野镜检。

2）淋巴结取材：先消毒淋巴结表面，再用1ml无菌注射器配12号针头，吸取0．2ml的生理盐水，注入消毒后淋巴结，反复抽吸数次后，吸出少量淋巴液直接滴加在载玻片上，加上盖玻片，暗视野镜检。

3）羊膜穿刺术：梅毒孕妇的羊膜穿刺术应由专业人员操作，将获得的羊水直接滴于载玻片上，暗视野。

（2）结果判定：根据其典型形态、大小和运动方式加以鉴别，镜下可见到折光性较强，有特征性运动方式的梅毒螺旋体即为阳性。一次阴性结果应重复检验。此方法由于取材不当或用药等都可出现阴性结果，所以如果是阴性，也不能完全排除梅毒。

2．冯泰纳（Fontana）螺旋体镀银染色法

（1）染液的配制

1）罗吉（Ruge）固定液：冰醋酸1．0ml，甲醛溶液2．0ml，蒸馏水100ml。

2）鞣酸媒染剂：鞣酸5g，苯酚（石炭酸）1g，蒸馏水100ml。

3）冯泰纳银溶液：硝酸银5g，蒸馏水100ml。

将硝酸银溶液20ml逐滴加到10%氨溶液中，产生的棕色沉淀物经摇动后可再被溶解。如溶液很澄清，可再加入硝酸银数滴，直到溶液摇匀后有轻度浑浊为止。此液应在临用前配制，不可预制。

（2）染色法

1）将标本制成徐片，宜稍薄。空气中干燥，不可用火焰固定。

2）滴加罗吉固定液，固定2～3min。

3）用无水乙醇洗涤。

4）加媒染剂2～3滴，用酒精灯火焰加热至产生蒸气，染30s，水洗。

5）滴加已经过氨液处理的银溶液，并加热使产生蒸气。染30s，水洗，空气中干燥。加盖玻片以加拿大胶封闭固定（如直接加油镜易使标本脱色），油镜检查。

（3）结果判定：螺旋体染成棕黑色，背景为淡棕色。

3．免疫荧光染色检查

（1）直接法：①将受检标本涂于载玻片上，直径不超过1cm，自然干燥，用丙酮固定10min。②已知抗梅毒螺旋体血清（人或免），用非致病性螺旋体（如Reiter株）培养物进行吸收，再用异硫氰酸盐荧光素（FITC）标记，然后涂在有标本的载玻片上，孵育30min。③彻底清洗，用缓冲甘油封固、待检。

（2）间接法：①取材固定同上。②加经吸收的已知抗梅毒血清，孵育30min，彻底清洗。③加FITC标记的抗人（或免）血清，孵育30min，彻底清洗，用缓冲甘油封固，待检。

（3）结果：在荧光显微镜下见到亮绿色螺旋体，荧光强度判为＋＋～＋＋＋＋，以完整的螺旋体为阳性。

4．临床意义

（1）暗视野显微镜检查法、镀银染色法，直接镜检到梅毒螺旋体，在临床上可确诊梅毒，且具有快速、方便、易操作等特点。暗视野显微镜检查法已被WHO指定为性病实验室必备项目之一。

（2）螺旋体检查是检测最早期现症梅毒的最好方法，对病人早期诊断、及时治疗、预后和尽早切断传染源具有十分重要的意义。对梅毒感染者，能在血清抗体出现前进行抗梅毒治疗，是最好的治疗时机。

5．注意事项

（1）取材前，应用无菌等渗盐水清洁皮损表面。

（2）钝刀要消毒，取材时应取到组织渗出液，以提高阳性率，并尽量避免出血。

（3）取材后应立即置暗视野显微镜下观察。

（4）暗视野检查要观察梅毒螺旋体的特征性形态和运动方式，对口腔溃疡标本，应与其他螺旋体相区别。镀银染色法和浓盐酸蒸汽显示法要观察到梅毒螺旋体的典型形态。

（5）如未观察到梅毒螺旋体，并不能排除梅毒的可能性，这可能是由于取材不当或皮损处螺旋体数量不足，病人近期用过抗生素，损害已接近自然消退等原因引起。可让病人复查及进行血清学追踪观察。

（二）梅毒的血清学检查

梅毒血清学检查分两大类：非梅毒螺旋体抗原试验和梅毒螺旋体抗原试验。

1．非梅毒螺旋体抗原实验 目前常用的有性病研究实验室试验，快速血浆反应素环状卡片实验和血清不需加热的反应素试验。这些试验一般用来做初筛试验，由于这些试验设备简单，操作比较方便，报告快速，易于推广，所以主要用于作为常规试验及适用于大量人群中进行筛查；可作定量（滴度）试验，用于观察疗效、复发及再感染；鉴别早期与晚期潜伏梅毒（早期治疗后滴度下降快，晚期下降慢或不变）。

（1）性病研究实验室试验（简称VDRL）：VDRL实验所用的抗原是从牛心中提取出来的有效成分：心磷脂、卵磷脂及胆固醇。梅毒螺旋体在破坏组织的过程中，体内放出一种抗原性心磷脂，它能刺激机体产生反应素。这种反应素与从牛心提取的心磷脂在体外有抗原-抗体反应。可作定量及定性试验。由于VDRL抗原的配制时混悬的技术较高，只可使用1日，而且待测血清需在试验前灭活，给实验室带来许多不便，所以主要用于梅毒病人的脑脊液检查。

（2）快速血浆反应素环状卡片实验（简称RPR）：RPR试验所用的抗原为改良的VDRL加胶体炭为指示物，试验在特制的白色纸卡上进行，在白色底板上出现黑色凝集颗粒或絮片为阳性反应。该试验结果容易判断，肉眼即可观察，血清不需灭活，也可用血浆进行检测。方法如下。

1）RPR定性试验：在卡片圆圈中加人50μl待检血清，并扩大到整个圆圈。用滴管和专用针头，加1滴RPR抗原悬液。在手或机械转动器（180r／min）转动卡片8min。

2）RPR定量试验：待测血清用等渗盐水在卡片上作数个稀释度：原血清、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等。按定性试验步骤操作，以出现阳性反应的最高稀释度报告结果。

3）结果判定：试验结束立即按下述标准判断结果。

阳性反应：在圆圈中可见不规则大小黑色凝集颗粒或絮片。

阴性反应：在圆圈中无黑色凝集颗粒，仅见均匀的不凝集现象（呈亮灰色）。

该试验仅报告“阳性”或“阴性”，任何程度的阳性反应都需作定量试验。

（3）注意事项：前带现象：RPR试验有时出现弱阳性或阴性结果，而临床上又像二期梅毒，此时应将此血清稀释后做定量试验，如出现阳性结果，此现象称为前带现象。其原因是血清中抗心磷脂抗体量过多，或因封闭抗体，或有非特异性抑制物所致。1%～2%二期梅毒病人可出现此现象而发生梅毒血清假阴性反应。

1）血清固定性反应（也叫耐血清性）：是指梅毒病人经过抗梅治疗后，非螺旋体抗原血清试验（RPR等）大多数可转为阴性，但有少数病人，血清反应滴度逐渐降低到一定程度即不在下降，而长期维持在低滴度，此种现象称为血清固定性反应。血清固定性反应的标准：一般认为早期梅毒治疗后2年，晚期梅毒治疗后2年以上血清反应仍保持低滴度阳性者。

2）梅毒血清反应的假阳性反应：就是指非梅毒病人的梅毒血清反应呈阳性。可分两大类：①非生物学假阳性反应，由于标本的保存（如细菌污染或溶血）、试剂的质量差或过期、实验室操作的技术所造成。②生物学假阳性反应，又分急性和慢性，引起急性生物学假阳性反应的疾病很多像麻疹、病毒性肝炎、疟疾等，但这些疾病梅毒血清反应滴度都很低，一般不超过1∶8，多在6个月内转为阴性，但TPHA试验阴性。另一个是慢性生物学梅毒假阳性反应，多见于结缔组织病、自身免疫系统疾病（红斑狼疮等）、麻醉剂止痛、孕妇等滴度也有1∶8以上，甚至1∶64，这种情况就要参考临床来诊断或确认试验。

如果病人为HIV感染者，其梅毒血清反应有时会出现难于解释的现象，艾滋病病人合并感染梅毒者，其梅毒血清试验均呈阴性。可能是由于HIV感染导致免疫功能低下，导致的无免疫应答，因此对于怀疑梅毒者，建议同时进行HIV抗体检查。

（4）甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）：甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）的检测原理和RPR相同，只是用甲苯胺红代替了炭颗粒，其检测方法、结果判读及临床意义等均同RPR试验。

2．梅毒螺旋体抗原试验 这些实验所用的抗原是梅毒螺旋体，检测血清中的抗梅毒螺旋体抗体，其敏感性与特异性均高。目前常用的有荧光螺旋体抗体吸收试验、梅毒螺旋体血球凝集试验及梅毒螺旋体明胶凝集试验等。这些试验一般用来作证实试验。这类试验检测的是抗梅毒螺旋体IgG抗体，即使病人经足量的抗梅治疗，血清反应仍长期保持阳性，因此不用于观察疗效、判定复发及再感染。有报道在一期梅毒阶段接受正规治疗者，15%～25%在2～3年后可转为阴性。

（1）梅毒螺旋体血球凝集试验（简称TPHA）：TPHA试验是用超声裂解的梅毒螺旋体为抗原，致敏经醛化、鞣化的羊或禽类红细胞，这种致敏的红细胞一旦与抗梅毒抗体或免疫血清相遇时，在适宜的条件下，产生肉眼可见的凝集。最早进入我国的TPHA试剂盒是日本生产的，由羊红细胞配成，致敏细胞和非致敏细胞为冻干品，配成细胞应用液，有效期短，反应时间长，目前已被TPPA等代替。

一般认为，TPHA试验阳性病人，由于记忆细胞抗体复制能力强，特异性试验敏感性高，即使经过抗梅毒治疗也终身阳性，因此不能作为治疗效果观察的指标。但根据临床观察，早期梅毒病人血清如TPHA试验为弱阳性反应，有可能阴转。

特异性试验对一期梅毒可比非特异性试验早1周出现。梅毒过程中最初出现的是IgM抗体，梅毒感染后第2周即可从血清测出，而IgG抗体则需在感染后第4周方可测出。因此检测195-IgM抗体可作为梅毒早期诊断或胎传梅毒的确诊。19SIgM治疗后阴转较快，在梅毒螺旋体抗原消失后不久，此抗体也随之消失。据文献报道经有效治疗后，一期梅毒3个月，二期梅毒9个月IgM抗体达到100%阴转。

梅毒确证试验，一般定性试验阳性，则可作梅毒诊断依据，必要时做定量试验。经有效治疗后特异性抗体滴度也可不同程度下降，可降至1∶160或1∶80。

此类试验特异性强，很少出现假阳性。据统计，也可有1%生物学假阳性存在如红斑狼疮（SLE）可使FTA-ABS呈假阳性；而传染性单核细胞增多症，可能由于嗜异性抗体所致，可使TPHA呈假阳性；麻风病病人的非特异性试验假阳性可高达40%，特异性试验有的也可呈阳性。

（2）梅毒螺旋体明胶凝集试验（简称TPPA）：TPPA试验与TPHA基本相同。TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒代替TPHA试验中致敏的红细胞，此致敏颗粒与人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体结合，产生可见凝集反应，具有较高的敏感性。明胶粒子为洋红色，在操作步骤上也较为方便，出结果较快。

（3）荧光螺旋体抗体吸收试验（简称FTA-ABS）：FTA-ABS试验是指将完整的梅毒螺旋体作为抗原，加上经吸收剂（用Reiter株螺旋体制备而成）吸收过的梅毒血清或免疫血清，形成抗原抗体复合物，再加入荧光素（FITC）标记的抗人免疫球蛋白（IgM、IgG）与抗梅毒螺旋体抗体结合，形成发光的抗原抗体复合物。在荧光显微镜下，螺旋体显出苹果绿色的荧光即为阳性反应。

荧光梅毒螺旋体吸收试验被认为是“金标准”试验，具有特异性高、敏感性强的特点。对一期、二期、潜伏期梅毒的敏感性分别是84%（70～100%）、100%和100%。特异性为97%（94%～100%）。但试验需有质量优良的荧光显微镜和技术熟练的操作人员，才能得到较为准确的试验报告。

（4）先天梅毒的实验室诊断：19S-IgM-FTA-ABS试验系检测抗梅毒螺旋体IgM型抗体。为避免血清受7S（IgG）的抑制而出现假阴性结果，故待检血清首先用IgM／IgG分离系统进行分离，采用间接免疫荧光法，其步骤与FTA-ABS试验大体相似，但应用荧光标记μ链抗人IgM抗体滴加于载玻片的抗原抗体复合物上，用落射式荧光显微镜观察。另外，19S-IgM还可作TPHA和ELISA。此试验可作为梅毒早期诊断、判定治愈及再感染的检测，并可与来自母体的抗梅毒螺旋体IgG型抗体区别，有助于诊断先天梅毒。

对于先天梅毒，不推荐用脐带血作梅毒检查，因为母亲血液中的反应素及螺旋体IgG抗体可经胎盘及脐静脉传递给胎儿，而出现假阳性反应；也不能用婴儿血清作梅毒螺旋体抗原试验（如TPHA、TPPA、FTA-ABS试验）。据研究，由母亲传递给胎儿的梅毒螺旋体IgG抗体，可在婴儿体内存留至生后15个月。有条件地区，可进行19S-IgM-FTA-ABS试验，对诊断先天梅毒有价值。

先天梅毒诊断的确证根据下列4个指标之一：暗视野查出梅毒螺旋体，患儿非梅毒螺旋体抗体滴度持续上升，非梅毒螺旋体抗体滴度高于其母亲，患儿检出抗梅毒19S-IgM抗体。

19S-Igm试验方法，是指通过检测沉降系数195的梅毒螺旋体单一成分的特异性IgM抗体来确诊梅毒的。IgM抗体是梅毒感染最早期产生的抗体，并能随疾病的治疗而逐渐消失。另外，IgM聚合体不能通过胎盘，因此，对先天梅毒确诊有特殊意义。另外，对一期梅毒非特异性血清反应阴性时的早期诊断，以及梅毒的再次感染和晚期梅毒的检测也有作用。一旦在胎盘血中检测到高滴度的抗梅毒螺旋体特异性抗体19SIgM，说明已感染梅毒。19SIgM还可作FTA-ABS和ELISA等项试验。

母亲是梅毒病人，患儿有早期或晚期先天梅毒的典型临床表现，或有早期先天皮肤黏膜损害，查到梅毒螺旋体，或梅毒血清学试验阳性，可作出先天梅毒诊断。

早期先天潜伏梅毒的实验诊断：母亲应肯定是梅毒病人，如患儿梅毒血清阳性，应排除被动抗体阳性的可能；如患儿非特异性试验滴度比母亲高，可能性大，以后按月检查，3～4个月内不转阴、滴度不下降或升高，则可诊断为早期先天潜伏梅毒。

母亲在妊娠晚期才感染梅毒，新生儿在4～12周内血清试验可为阴性，这不能排除先天梅毒的可能。如已感染，4个月后便可呈阳性。

为防止发生先天梅毒，应在婚前和产前作梅毒血清学检查。在梅毒高流行区，还需在妊娠期第九个月重复进行血清学筛查。产前发现梅毒不论以往是否经过治疗，都要在妊娠初期3个月内接受青霉素1个疗程的治疗；妊娠末期再治1个疗程，以治愈可能被感染的胎儿。对梅毒孕妇所生的婴儿均应进行血清学检查和追踪观察。