六、HIV-1耐药检测

HIV-1耐药检测的方法可分为两大类：一类是基因型检测法；另一类是表型检测法。常用方法为HIV-1基因型耐药检测法，它主要有美国FDA批准的ViroSeqTMHIV -1基因型自动检测法、TRUGENERHIV -1基因型半自动检测方法和各实验室自建的（In－house或Home－brew）方法。自建法与前两种方法检测结果的准确性无显著性差异，并且价格低廉，以下主要介绍此方法。

（一）样品采集和处理

要求HIV感染者血浆病毒载量≥1 000拷贝／ml或国际单位，采用血浆、滤纸干血斑样本。

（二）检测试剂

1．引物 根据所检测的目的基因、参考文献和本地HIV -1流行毒株的序列设计扩增和测序引物。

2．主要试剂 实验室自建方法需配置病毒核酸提取、反转录、PCR和测序反应等步骤所需的试剂。

（三）核酸提取

按照核酸提取试剂盒说明书操作，提取血浆RNA常用QIAamp viral RNA Mina Kit试剂盒，提取DBS样品中的总核酸（RNA和DNA）常用NucliSENS RNA Isolation Kit试剂盒。实验中应加阴、阳性外部对照，提取RNA时应注意防止RNA降解。RNA和需长期保存的DNA应在－80℃保存。

（四）反转录和PCR扩增

将RNA模板、反转录引物、dNTP、反转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液和适量无RNA酶的超纯水加入反应管中，在适宜温度下进行反转录反应，合成cDNA。将模板（DNA或cDNA）、dNTP、引物、缓冲液、TAQ酶和适量灭菌纯水加入反应管中，放在扩增仪上，按照设定的程序进行PCR扩增。建议使用一步法试剂进行第1轮扩增反应。

（五）序列测定

通常采用Sanger法进行DNA测序。将扩增产物、dNTP、ddNTP、测序引物、缓冲液、Taq酶和适量灭菌纯水加入反应管中，置于扩增仪上，按照设定的程序进行测序反应，在测序仪中读取序列数据。也可以送到有资质的商业测序公司进行。

（六）耐药程度分析

提供HIV-1耐药基因型检测数据分析和解释系统（HIVDRDB）的主要机构有：

1．国际艾滋病协会（IAS，http：／／www．iasusa．org）。

2．美国斯坦福大学（HIVDB，http：／／hivdb．stanford．edu）。

3．法国国家艾滋病研究署（ANRS，http：／／www．hivfrenchresistance．org／index．html）。

4．比利时Leuven大学Rega医学研究所（REGA，http：／／www．kuleuven．ac．be／rega／cev／）。

（七）检测结果的分析解释

1．耐药相关的基因突变 分基因区报告耐药相关的基因突变，可将蛋白酶（PRO）和反转录酶（RT）两个基因区的基因突变分开报告。基因突变表示方式为“字母-数字-字母”，第1个字母代表野生型病毒株特定密码子处的氨基酸，第2个字母代表在特定密码子处替换了的氨基酸。

2．耐药程度分析 每个HIV -1耐药基因型解释系统对耐药程度的报告是不同的：HIVDB系统分为敏感（S）、潜在耐药（P）、低度耐药（L）、中度耐药（I）和高度耐药（H）5个水平。Rega、ANRS和商品化试剂盒所采用的系统则分为敏感（S）、可能耐药（I）和显示耐药（R）3个水平。

3．其他 当耐药毒株在个体内病毒群体中的比例低于10%～20%时，通常检测不到其存在。因此，当在HIVDB、Rega或ANRS系统中报告为“S”，只可报告本次实验结果为“未发现耐药”，不能报告为“敏感”。