五、HIV核酸检测

HIV核酸检测分为定性和定量检测。

（一）定性检测

可检测单个样品或多个混合样品（集合核酸定性检测，Pooling PCR）。方法分为商品化试剂盒和实验室自建方法两种，商品化试剂应严格按说明书操作。以下介绍的是实验室自建方法。

检测血浆或血清样品使用反转录PCR（RT-PCR）方法，建议第1轮PCR扩增使用RTPCR一步法；检测血细胞或组织样品使用PCR方法。一般使用扩增两轮的套式PCR方法。

设立阳性、阴性及空白对照。阳性对照为与待测样品同质、含有目的基因的样品；阴性对照为与待测样品同质、不含有目的基因的样品。阳性和阴性对照样品应与待检样品处理程序一致。阴性对照的设置数量应根据实验样品的数量设置在不同的位置。

1．试剂

（1）PCR引物：一般使用扩增HIV gag和（或）pol和（或）env和（或）LTR等引物。进行RNA反转录时可使用下游特异性引物或随机引物。引物设计可参考文献或自行设计，应尽量涵盖常见的HIV流行毒株，也可使用兼并性引物。

（2）主要试剂：包括核酸提取纯化、反转录、PCR所需的试剂。使用商品化核酸提取纯化试剂、反转录酶反应试剂和PCR扩增试剂。

（3）抗污染试剂：实验室自建检测方法可使用抗污染试剂，参考尿嘧啶DNA糖基化酶抗污染方法。

2．扩增目的基因片段

（1）核酸提取：可使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA时应注意防止RNA降解。DNA应置于－20℃保存，RNA和需长期保存的DNA应置于－80℃保存。

（2）反转录合成cDNA：使用商品化试剂并按说明书操作。反转录cDNA合成反应需使用反转录引物、dNTPs、反转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA／DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行反转录反应。建议使用商品化RT-PCR一步法试剂进行第1轮扩增反应。

（3）PCR扩增反应：使用商品化试剂按说明书操作。PCR反应需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、缓冲液、和适量无RNA／DNA酶超纯水，以及模板（DNA或cDNA）。在扩增仪中，按照设定的程序进行扩增。一般使用2次扩增的套式PCR扩增方法。

3．扩增产物分析及结果报告

（1）扩增产物分析：扩增产物常用分析方法是琼脂糖凝胶电泳法，与分子量标准比较，判断扩增片段是否在预期的分子量范围内。其他扩增产物分析方法还有限制性内切酶酶切分析、特异性探针杂交分析及DNA序列分析等。自动化核酸扩增仪使用酶联比色分析或荧光探针杂交等原理测定。

（2）结果判定和报告：实验成立的条件：每一次检测需同时做两个阳性对照、两个阴性对照，只有阳性对照扩增出预期的片段、阴性对照没有扩增出任何片段、双份平行样品结果一致的情况下实验才成立，可以作出核酸阳性或阴性反应结果的判定。HIV核酸检测阳性：使用商品化检测试剂，发现核酸阳性反应，应该重复采集样品进行复测，复测结果呈核酸阳性反应则判定为核酸阳性，复测结果为核酸阴性反应则判为不确定结果，需进一步随访检测。HIV核酸检测阴性：只可报告本次实验结果阴性。

（二）定量检测

HIV-1载量检测根据方法的原理不同分为核酸序列依赖性扩增（NASBA）技术，实时荧光定量PCR扩增（real－time PCR）技术，分枝DNA信号放大系统（bDNA）技术。

1．核酸序列依赖性扩增（NASBA）技术 此技术是以一种等温扩增系统。其代表产品为实时荧光技术NucliSens EasyQ分析仪，它通过结合NASBA技术、BOOM核酸提纯技术与分子信标探针技术检测血浆中的HIV RNA水平。

2．实时荧光定量PCR扩增（real－time PCR）技术 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它的代表产品包括Cobas Amplicor Taqman检测系统、M2000检测仪和一些国产仪器。

3．分枝DNA信号放大系统（bDNA）技术 基于其独特的信号放大系统（分枝DNA信号放大系统），为一个人工合成的分枝DNA，它的分枝可结合多个酶标记物，从而将病毒的信号放大，以便进行检测。代表产品为Bdna440病毒载量检测仪。