（一）样品种类、运输和接收

1．样品种类 采用抗凝全血，应选择合适的抗凝剂。①用于血液学检测的抗凝剂：K3EDTA或K2EDTA抗凝管；②用于流式细胞仪免疫表型检测的抗凝剂：K2EDTA、K3EDTA、酸性枸橼酸葡萄糖溶液（ACD）或肝素抗凝。一般要求48h内染色，染色后6h内分析。如采血后24h内染色，则可在染色后24h内分析。如利用CD45单克隆抗体和侧向光设淋巴细胞门，可检测放置72h的样品。

2．样品运输 室温（18～25℃）保存和运输样品，高温季节，需用隔热容器盛装样品，并将样品置于有冰袋和吸热物质的容器中。

3．样品接收 由专人接收样品，检查样品数量并核对标识；溶血、凝血或结冰的样品应视为不合格样品，超过检测允许时间的样品不可检测；如果样品运输过程中温度超出室温范围，但没有明显的溶血或结冰，可以处理样品，但要在工作表的报告上注明温度条件。

（二）检测方法

CD4＋T细胞和CD8＋T细胞计数的方法分为两大类：一类是应用流式细胞仪测定法；另一类是非流式细胞仪测定法。常用的淋巴细胞计数检测方法为自动检测方法，包括流式细胞仪（主要有多平台法和单平台法）和专门的细胞计数仪。

1．流式细胞仪检测方法 可分双平台法和单平台法两种。

（1）双平台方法：是一种细胞群体的绝对计数方法，利用血球计数仪检测淋巴细胞数量，再根据流式细胞仪得到的细胞群体百分比，计算得到每微升的淋巴细胞数量，这种方法称为双平台方法。双平台法需要两种仪器，由于仪器有系统误差，计算结果的重复性和准确性影响因素较多，用这种方法进行CD4＋和CD8＋T细胞计数时，不同实验室差异很大。这种方法最大的缺点在于操作步骤复杂，操作人员多、费时。因此，很难将变异水平减小到最低。

（2）单平台方法：是相对双平台法而言的，即应用三色、四色流式试剂配以内参绝对计数微球，加上流式细胞仪淋巴细胞亚群获取和分析软件，一步即可获得T细胞亚群的相对数（百分比）和绝对数。通过使用已知数量的参考微球为内参，可以直接报告绝对计数，即通过获取的目标细胞与参考微球的比例、参考微球数量和样品体积，得到每微升的淋巴细胞数量。单平台法最大限度地减少了多个仪器检测带来的检测误差，细胞绝对计数结果的重复性和准确性都得到了良好的保证。

2．非流式细胞仪测定法

（1）Cyto-Spheres方法：CD4＋计数试剂盒包含CD4＋微球试剂，即包被有单克隆抗体的惰性乳胶微球，可以通过光学显微镜鉴别和手工计数新鲜全血中CD4＋T细胞的绝对数。其原理是人和动物的T细胞表面有红细胞受体，因此红细胞可以黏附到T细胞的周围而形成玫瑰花样的细胞团。在红细胞中，以绵羊红细胞最为常用。

（2）Dynabeads方法：以免疫磁珠细胞分离方法为基础，使用包被CD4＋和CD8＋抗体的Dynabeads磁珠，从全血中捕获分离CD4＋T细胞和CD8＋T细胞；另一种CD14微球用来阻隔单核细胞。用甲紫（龙胆紫）和台盼蓝染色分离出来的CD4＋T细胞，在光学显微镜下或自动细胞计数仪上计数。