二、药用次生代谢产物的生产

（一）用细胞培养的方法生产药用有效成分

1.植物细胞特性 悬浮培养是植物细胞大量培养用以生产药用有效成分的适宜状态，由于其培养过程与微生物培养有一定的类似性，因而受到广泛关注和大量的研究与使用。但植物细胞与微生物细胞之间存在的差异性，以及植物细胞自身的特点，是我们设计培养条件时必需予以重视的。

如植物细胞比细菌或某些真菌细胞大10～100倍，直径一般在20～150μm之间。不同来源的细胞如不同种类植物的细胞，或者同一种类不同组织的细胞，在大小和形态上均存在很大的差异。其代谢功能、呼吸作用通常比微生物细胞弱，分裂和增长的速度也较微生物慢很多，仅有极个别高度特化的植物细胞系增长的速度能与微生物生长的速度相当，如某些烟草的细胞系。

此外，植物细胞，包括培养中的植物细胞，均具有厚度不一的含纤维素的细胞壁，因而易于聚集，质地较脆弱。当其处于对数生长初期时，细胞体积较小、具浓密的细胞质、较大的细胞核、明显的核仁以及为数不多的小液泡。此时内质网发达并具多数的核糖体，与分生组织细胞相似，细胞分裂频率也较高。而当细胞的分裂状态基本停止，细胞群体处于对数生长后期的细胞体积变大，细胞质变稀，细胞核从中部移至靠壁部位，只具有很小的核仁。一个被胞质分隔为若干部分的大型液泡占据细胞中心的大部分位置。而大型液泡内常含有细胞积累的有毒物质和某些水解酶类，其释放会造成对培养细胞的危害。

对于某些植物，在其细胞对数生长期即可合成次生代谢产物，如长春花Catharunthusroseus培养细胞系在对数生长期可合成长春花碱。但对于多数植物的培养细胞来说，处于对数生长后期或处于一定的分化状态时才能开始合成次生代谢物质，或者对次生代谢产物的产量具有一定的影响；有的还需要产生一定的组织分化（产生不完全的输导组织）后才能开始某些次生代谢物的生物合成。如对可可Theobroman cacao的悬浮细胞研究者曾使用几十种培养基，但即使到了对数生长期后期，仍未发现可可油的产生，只有当子叶下轴中大量诱导出体细胞胚后，在一定的培养条件下才能在成熟体细胞胚的子叶内部积累可可油。因此常使用以尽量在最短的时间内获得大量的植物细胞生物量的第一阶段与以尽量得到更多的目标产物为目的的第二阶段培养相结合的二步法培养系统，生产药用次生代谢产物。如Y．Yamada等（1983）建立了生产紫草宁的悬浮细胞培养体系；李宝健等建立了长春花碱的长春花培养细胞系统。上述两个培养阶段的培养基中植物生长素的种类及其浓度的差别是主导差别因子。

2.植物细胞大规模培养 在大规模培养过程中，开始时必须经过一个纯粹的生物量（即细胞量）的增长阶段，为随后的生物合成提供基础。这一阶段可分为3～5个被称为“种子细胞培养”的阶段。如从起始的1L细胞培养罐，逐级接种于10L、100L、1000L、10000L的培养罐中，依细胞系特性进行培养，培养时间通常为10d左右，密度以1000个细胞／m L为宜，使细胞处于对数生长初期。此后可进入以尽量得到更多的目标产物为目的的第二阶段培养。培养时，植物细胞多数由于细胞间表面的粘连而以大小不一的细胞团存在，每个细胞团内含几个、几十个至几百个细胞不等。仅在少数情况下，它们以单个“自由的”细胞形式存在。这些单个细胞有两个形成途径：一种是在细胞分裂后，两个子细胞完全分开，这种现象在对数生长期的早期阶段出现；另一个途径是由各种原因导致细胞团上的单细胞脱落。

3.次生代谢产物高产细胞体系的建立

（1）高产细胞株的筛选：次生代谢产物的产量主要由培养细胞的遗传因素所决定。一般次生代谢产物高产的植物种类、品种或它们的高产植株，都可成为高产的培养细胞系统的来源。但许多实验证实，相同来源的植物细胞在生产次生代谢物的潜在能力上具有异质性，即培养物中同时具有次生代谢物高产和低产的细胞。可以通过筛选高产细胞系来解决。在选择高产细胞株前，必须通过实验摸索出对细胞培养和次生代谢物生产相对最佳的培养步骤、条件和体系，然后在此体系中对细胞进行筛选。

具体筛选方法为：先从药用植物高产株的次生代谢产物含量最高的部位选取外植体材料，诱导培养愈伤组织；将每个愈伤组织切成若干小块，然后在含有适当含有不同种类和浓度的生长激素的培养基中，于28℃下培养10～14d；然后将每个由小的细胞团长出的愈伤组织，在无激素的培养基上进行继代培养，将产物分为两半，一半用于次生代谢产物的分析；另一半进行继代培养。待化学分析的结果明确后，将次生代谢物含量最高的组织块，再切成多个小块，接种并继代培养，重复上述筛选步骤。多次之后，就可选出次生代谢物产量最高的细胞团。

（2）培养体系的建立与优化：在高产细胞株筛选确定之后，可对用于筛选的培养体系及相应的培养条件进一步优化，如在通常应用的基本培养基中适当添加植物激素、维生素或其他化学药品特别是前提化合物的添加，如将雷公藤属Tripterygium植物茎中诱发的愈伤组织置于含有3％蔗糖、1mg／L激动素、1～3mg／LNAA的MS琼脂培养基中，经5～6次继代培养（每次约30d）或者置于相同配方的液体培养基中，经10～20d的悬浮振荡培养后，提取物中均发现含有具抗肿瘤活性的细胞毒素物质雷公藤乙素（tripdiolide），其含量比母本植物高4.3倍。培养三分三愈伤组织时，在生长后期供给1mg／L激动素，可使莨菪碱的含量比原植物中含量提高很多。对芸香组织培养时，在培养基中添加白鲜碱的前提化合物4羟基2喹啉酚，可促进白鲜碱的合成和积累。

（二）用毛状根生产药用有效成分

如前所述，几乎所有的双子叶植物和少数单子叶植物及少数裸子植物在受到土壤发根农杆菌感染后，能够诱导形成毛状根。毛状根的表型可进行离体培养，并在继代培养中稳定下来，在生长中不需要外来激素，且很多植物的发根在离体培养条件下都能表现出原植株次生代谢产物的合成能力，甚至较原植株含量高，因此毛状根培养可被用于药用次生代谢产物的生产。

此外，转基因毛状根同样可作为药用有效成分的生产材料。如转透明颤菌血红蛋白基因（vitreoscilla haemoglobin gene，vgb）黄芪毛状根可有效提高黄芪甲苷的含量。

复 习 题

【填空题】

植物组织和细胞培养的理论基础为 ____，即提供适当的外部条件，一个多细胞有机生物体的每一个活细胞将能够独立生长，并有能力发育并繁殖成为一个完整的生物体。

【简答题】

1.试述何为“细胞全能性”。

2.试述植物组织培养的一般方法。

3.常规培养基由哪几类成分组成？各有何作用？

4.试述植物离体培养中激素种类与作用。

5.什么是悬浮细胞培养？它有何特点？

6.试述如何获取单倍体植株。

7.何为原生质体？原生质体培养有何意义？

8.试述如何建立植物快速无性繁殖体系。

9.植物快速无性繁殖技术有何作用？

10.基因克隆的常用方法有哪些？

11.转基因植物确定的主要标准有哪些？

12.如何筛选获得次生代谢产物含量高的细胞株？

13.为何毛状根培养技术可用于植物次生代谢产物生产中？

14.植物细胞培养技术用于生产药用有效成分有何优缺点？