一、植物组织培养

植物组织培养（plant tissue culture）是应用无菌技术，将从植物体分离出来的组织置于含有合成培养基（medium）的适当容器中，使之在无菌条件下生长或发育的一种方法。此方法易于观察研究植物细胞、组织或器官的生长、分化、发育和无性繁殖，以及各种外界因素对它们的影响，同时可用于植物的快速繁殖、植物次生代谢产物的生产等，因而目前除在药用植物研究和生产领域的广泛应用外，在农林业、花卉产业等研究和生产领域同样也获得了广泛的应用，并已有若干重要成果应用于生产实践中。

（一）植物组织培养的方法

1.外植体（explant）的选择 作为培养材料的植物体部分或片段统称为外植体。从低等的藻类到苔藓、蕨类、种子植物等高等植物体的各个部分的各种组织都可作为外植体使用。一般裸子植物多采用幼苗、芽、韧皮部等；被子植物则多采用胚、胚乳、子叶、幼苗、茎尖、根、茎、叶、花药、花粉、子房和胚珠等。多年实践证实，同一植株的各部分在离体培养条件下的脱分化和再生能力是不相同的，通常幼嫩部分比成熟部分更适于用作外植体。

2.外植体的灭菌处理与接种 外植体接种前必须进行灭菌处理。常用方法是从洗净的植株上取适当组织置于具螺旋盖的瓶中，随后注入适当浓度灭菌剂，使材料浸没在灭菌剂中，盖上盖子，将瓶置于超净台处理适当时间，期间摇动数次。常用消毒剂有升汞溶液、次氯酸钠溶液、过氧化氢、乙醇等。消毒剂的种类、浓度及处理时间应根据所选择的外植体而定。灭菌处理的目的是使材料无菌且保持活性。处理后，用无菌水反复冲洗，并用无菌吸水纸吸干多余水分，迅速接种在提前灌装于适当容器的培养基上。

3.培养 在组织培养中，培养基、温度、光照、通气等均是培养成功的重要条件，其中培养基将分段另述。温度一般在20～28℃可满足多数植物材料的生长需要，且以（25±2）℃为宜。光照的有无、强度、光质与照射时间则应根据培养对象和研究目的而定，如在诱导器官分化时，通常需要一定强度的光照。在使用固体培养基培养时，无需采取特殊的通气措施，而液体悬浮培养时，细胞的生长需要良好的通气条件，小量悬浮培养可采用摇床进行转动和振荡，大量悬浮培养时则需要专业的通气和搅拌装置。

培养过程中，在适宜的条件下，受伤组织切口表面不久即能长出一种脱分化（dedifferentiation，使已分化的体细胞回复到未分化的原始状态并具有细胞全能性的表达潜力）的组织块，称为愈伤组织（callus）。此种愈伤组织在适当的培养基上经一定时间能够诱导生长成特定组织、器官或整株植株，而各阶段的培养产物在适宜的培养条件下，均可长期传代下去，这种培养称为继代培养（subculture）。但在继代培养过程中，不少植物培养的组织或细胞随着继代培养代数的增加，会发生遗传性的改变，其中染色体的变化发现较多，主要有多倍性或非整倍性细胞的出现。

（二）培养基的组成

在离体培养条件下，不同植物以及同种植物的不同器官、组织对外界培养条件均有不同的要求，只有满足了各自的特殊要求，才能获得良好的生长。培养基的组成是培养物生长和分化至关重要的影响因素，此外，p H和渗透压对培养物的生长和分化也具有重要影响。

在过去的几十年中，为了满足培养各种组织和器官的需要，国内外学者已研制了若干种培养基配方，见表131。

上述常用培养基的组成成分大致可分为以下几类。

1.无机营养成分 无机元素在植物生长发育中非常重要，如氮（N）是各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组成部分，镁（Mg）是叶绿素分子的一部分，钙（Ca）是细胞壁的组分之一，铁（Fe）、锌（Zn）和钼（Mo）等是某些酶的组成部分。按照国际植物生理协会的建议，植物所需要的浓度大于0.5mmol／L的元素为大量元素，小于0.5mmol／L的元素为微量元素。在植物组织培养中大量元素除碳（C）、氢（H）、氧（O）外，主要有氮（N）、磷（P）、钾（K）和硫（S），而钙（Ca）、钠（Na）和镁（Mg）等元素的需求量相对较少。微量元素一般包括铁（Fe）、铜（Cu）、锰（Mn）、锌（Zn）、钼（Mo）、钴（Co）、碘（I）、硼（B）等。

当某些元素供应不足时，组织生长和发育会出现一些特殊的症状。如缺氮使某些组织表现出很注目的花色素苷的颜色，愈伤组织不能形成导管；缺铁时，细胞分裂停止；而缺锰或铜则会影响细胞的生长。

2.有机营养成分 虽然大多数培养物能够合成所有必需的维生素，但合成能力有限，所以为了能使组织很好的生长，在培养基中常常必须补加几种维生素和氨基酸。已知硫胺素（维生素B1）、吡哆醇（维生素B6）、烟酸（维生素B3）、泛酸钙（维生素B5）、硼酸、甘氨酸等能显著地改善培养物的生长状况。

此外，为了促进某些愈伤组织和器官的生长，有时还在培养基中添加灭菌的、化学成分不明的复杂营养混合物，如水解酪蛋白、椰子汁、酵母提取液、麦芽浸出物、玉米胚乳以及水果汁等。但这类物质，特别是果实提取物，因为其中所含的生长促进成分的质和量常因来源样品的差异和采集使用时间的差异而不同，又难以定量调整，常会影响实验结果的重复性，所以在可能的情况下，应避免使用。

3.碳源 离体植物培养物在培养基中通常不进行光合作用，依赖于外界碳源而生存，是异养的。绿色组织会在培养过程中会逐渐失去叶绿素，而在培养期间获得了色素的组织，也并非碳素自养。如果在培养基中加入合适的碳源，也会使已经充分分化了的绿色幼茎生长得更好。常用的碳源主要有蔗糖、葡萄糖、果糖等糖类，其中以蔗糖最为常用，浓度一般为2％～4％。

碳源除了作为植物生长发育所需的营养物质外，另一个重要的功能是调节培养基的渗透压。如在水稻花药培养中，常规培养条件下，花丝和花药壁组织常比花粉粒更易于诱导产生愈伤组织，但如果培养基中增加蔗糖的含量至15％，则可有效地抑制花丝和花药壁组织产生愈伤组织，从而获得花药培养物。

4.激素 激素是植物体内天然存在的代谢产物，对细胞的生长、发育和分化都起着重要的调节作用。在植物组织培养时，常根据培养物的内激素水平不同而添加不同外源激素。常用的激素有生长素和细胞分裂素两大类，另外还有赤霉素和水杨酸等。其中生长素类有吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、2，4二氯苯氧乙酸（2，4 D）和萘乙酸（NAA）；细胞分裂素类有激动素（KT）、玉米素（zeatin）和6苄氨基嘌呤（6 BA）等。大量研究结果表明，细胞分裂素类物质和生长素类物质的种类、浓度与比例对诱导植物器官分化起着重要的调节作用，如一般情况下，生长素／细胞分裂素低时，愈伤组织分化出不定根，而该比例高时，愈伤组织分化出不定芽。

5.琼脂 琼脂是一种由海藻提取获得的多糖类物质，在培养基中加入0.5％～1％可使培养基成为半固体。在这种半固体培养基上所建立的培养系培养简便，不需要摇床等机械设备，且便于保存，所占空间少，而且对于多种目的的实验均具有令人满意的结果，因此琼脂固化培养基得到了广泛的使用。但因为几乎所有琼脂都含有杂质，特别是含有Ca、Mg和微量元素，所以在进行营养需要研究时，不可使用琼脂。另外，不同批次的琼脂成分和质量具有一定的差异，采购时应予注意。

（三）培养基的配置

首先应根据培养目的、培养物的类型和特点确定培养基的配方。除营养、诱导分化作用成分外还应当注意p H、渗透压、离子平衡和毒性问题。无机盐类一般需使用化学纯的化合物，p H可用1mol／L的KOH（或Na OH）溶液和2mol／L的HCl调整，植物组织培养一般p H为5.8；使用半固体培养基，p H高于6，培养基将会变硬，低于5，琼脂不能很好地凝固。

配制培养基最方便的办法是先制备一系列母液，大量元素可先配制成使用浓度10～20倍量的母液备用；微量元素由于用量少，可先制备成使用浓度200倍量的母液备用，以保证微量元素的含量准确；除蔗糖外的有机物和铁盐也常分别配制成使用浓度200倍量的母液备用。激素类物质则应根据各自溶解性单独配置母液。所有母液均需置于4℃冰箱保存，铁盐需使用棕色玻璃瓶避光保存。一些常用的培养基如MS、B5和White培养基等，国内外均有商品母液供应，可大大地方便培养基的配制和质量的标准化。使用母液之前必须轻摇瓶子，确保其中没有沉淀物和微生物污染。然后依据配方配置培养基，并高压灭菌，对于必须在高压灭菌后加入的物质，可使用0.22μm的微孔滤器过滤灭菌添加。