基因工程是怎样“施工”的

基因工程是一项非常复杂的技术操作，它的环节之繁多、操作之细致是其他工程所无法比拟的。但是如果跳开细节问题，基因工程操作流程还是比较明了的。它的基本步骤大致可归纳如下：

制备所需的基因

mRNA结构

这一步就是人们依据工程设计中所需要的某些DNA分子的片段，它含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。DNA的种类繁多，每个DNA分子所包含的基因也很多，但它在细胞内的含量却很少。因此，要获得一定量的目的基因，是一件十分复杂的细致工作。目前采用的分离、合成目的基因的方法有多种。如：超速离心法，是根据不同基因的组成不同，其浮力、密度等理化性质也不同的原理，应用密度梯度超速离心器，直接将不同的基因分离出来；噬菌体摄取法，是利用噬菌体侵入到细菌细胞中，其染色体能与细菌细胞染色体整合并一同复制的特性。在一定条件下，噬菌体可以从细菌中释放出来，并带出一部分细菌的染色体，从而可以从带出的这些细菌染色体上获得目的基因；反录酶法，是先分离出特定基因的mRNA，再用反转录酶作催化剂，以mRNA为模板，合成所需要的DNA目的基因；分子杂交法，先用加碱或加热的办法使DNA变成单链，而后加入有放射标记的RNA，让DNA在特定条件下，结合成DNA与RNA的杂合分子，再用多聚酶制备出足够数量的双链的DNA分子，进而获得DNA目的基因；霰弹枪法，是用酶将已切割成的DNA片段与载体混合生成杂合子，再导入到大肠杆菌中去繁殖，然后分离筛选出所需要的目的基因；合成法，如果已知道基因DNA的碱基排列顺序，就可以采用不同的核苷酸为原料，用特定的酶催化，直接合成目的基因。

DNA克隆

选择基因载体

在基因工程中必须把外源基因转移到宿主细胞中去。要实现这种基因转移，还需要一种合适的运转基因的载体。理想的载体要具备如下条件：能够自我复制，大小要适度，能从外部进入细胞；稳定安全可靠，要有遗传标记和选择性的识别标记。通常选用的基因载体有3类：一类是细菌质粒。它是存在于细菌细胞中染色体外的环状的DNA，也叫“核外遗传体或外染色体”，是具有遗传特性的物质。由于它能独立复制，也能组入到宿主细胞中，与宿主细胞的染色体一起复制、转录、翻译表达，因而在基因工程中是常被选用的载体。例如：土壤根癌农杆菌中有一种环状DNA物质——Ti粒，它能够带着重组的基因稳定地整合到宿主细胞核的基因中去，进行复制、转录和表达。Ti质粒是目前高等植物基因工程中，常被选用的基因载体；另一类是噬菌体和病毒，如N一噬菌体和SV₄₀（猿猴病毒）等，在微生物和哺乳动物体细胞的基因工程中，作为基因载体已广泛被应用。在植物病毒中，除了利用自然无毒的病毒品系，如抗烟草花叶病毒（TMV）外，对其他绝大多数的病毒都必须进行若干修饰或改造，才能成为可用的基因载体。修饰改造的目标之一，就是要减弱或消除病毒的致毒性，使其引起宿主细胞病症的毒性降至最低水平，并在使用过程中使其原有毒性不至于复发。此外，再有一类载体就是转座因子、人造粘接体等。它们的主要成分都是不同的脱氧核糖核酸（DNA）。

除运用化学物质诱导细胞摄入基因的方法外，将外源基因直接导入受体细胞的方法也不断研究和采用中，它能有效地提高DNA的转化率。下面介绍几种常用的方法。

1．电激法。这是用瞬间脉冲刺激细胞膜，在一定强度的电脉冲作用下，使其脂质部分形成若干可以逆转的小孔，以增加通透性而不损伤细胞膜的基本结构。这些孔就成了外部重组的DNA分子进入细胞的通道。电脉冲的强度可决定孔的直径大小和数量，孔的直径大小又决定了DNA进入细胞的速度和难易。但是如果电脉冲强度超过了临界，细胞膜就会遭到不可逆转的破坏。美国农业局的科学家詹姆斯·桑德思和本杰明·马修斯成功地将大肠杆菌产生的β－葡萄糖苷酸酶（Gus）的基因，用电脉冲植入到烟草发芽的花粉细胞中，在再生的烟草植株内发现了Gus。他们先将细菌的基因提取出来，当烟草的花粉粒发芽并长出花粉管时，就立即将二者混合放入一试管中，试管里有两根相距两毫米的不锈钢的电极。当通上电流后，两极之间产生了很强的电脉冲，持续时间80微秒，电势为9千伏/厘米，使花粉管上被击出一些小孔。这些小孔能持续开放30分钟左右，GUS的DNA就由这些人眼看不见的小孔进入到花粉细胞中，而花粉壁因较厚不会被电脉冲击穿。

2．微注射法。在显微操作和相差显微镜等精密技术设备条件下，用毛细管针将外源基因直接注射到细胞中去。

3．激光打孔注入法。用激光在植物细胞壁、细胞膜和核膜上开孔，将开了孔的细胞浸于外源基因培养液中，培养液的浓度应略高于细胞内液体的浓度，使外源基因从孔中注入细胞内。日本用这种方法已成功地给大麦注入了外源基因，速度比较快，30～40分钟就能给几万个细胞注入完毕。

4．黄金弹射入法。用极微小的固体黄金颗粒为子弹，弹上涂上DNA，放在一张非常薄的膜上，然后用加压的氦气射流把薄膜猛烈地击入一个滤网，使膜上的黄金微粒以接近手枪子弹的射击速度，穿过薄滤网和细胞膜，进入细胞内。美国得克萨斯大学西南医疗中心的研究人员，已经成功地把涂有萤火虫基因的黄金子弹，射入了小鼠的皮肤和肝细胞内，并证实被射入的基因在10%～20%的受轰击的细胞内工作了14天，研究人员寄希望用这种办法，把某些基因射入人体细胞，以矫正和医治由于基因缺陷或掉失而引起的各种疾病。

5．“基因枪”法。是用各种特制的“基因枪”把带有外源基因的“微型弹”直接嵌入受体细胞中去。美国有两个研制作物种子的科研小组，都宣布他们使用了一种相同的“基因枪”，把涂有外源基因的小弹丸射到了玉米细胞里面去，并得到了表达。这两个实验小组中一个实验小组在弹丸表面涂的是一种能产生萤光的基因，这种基因引入到试验的玉米细胞中之后，能促使玉米产生比较低但却可以探测得到的微弱的光线。研究人员说：这两种特殊基因中的任何一种都对玉米特别有用，而且“基因枪”技术代表着可以把具备任何特性的基因引入谷物内的研究发展方向。

基因工程为科学研究和生产实践开辟了一条新路。过去用传统方法要试验研究基因在新的遗传环境中的功能，以及验证它对生物的影响，是不可能进行的，而现在已成为遗传研究中的常规手段。用基因工程生产人们所需要的生物产品，已成为新兴的产业。1997年，美国加州的科学家将生长激素释放抑制因子的基因转入大肠杆菌，在大肠杆菌培养液中，生产出了这种由14种氨基酸组成的多肽激素，仅用9升培养液，就提到了5毫克激素。这相当于从50万只羊的下丘脑中所能提取到的激素量的总和。1979年，美国又利用细菌生产人的胰岛素，以满足医治糖尿病的需要。他们用基因工程把人的胰岛素基因导入大肠杆菌，用几公斤培养大肠杆菌的发酵液，就生产出了3～4克胰岛素，相当于过去从100千克大家畜胰脏中才能提取出来的胰岛素数量，而且生产过程也简便得多。

基因转移

把所取得的基因引入细胞的方法随接受这基因的细胞的不同而不同。接受基因的细胞可以大致分为3类：以细菌和酵母菌为主的微生物，人、家畜和实验动物的细胞和植物细胞。

转化是把基因引入微生物细胞的常用方法。转化是细菌在特定的生理状态下摄入DNA的过程。一种称为电击穿孔的方法则较少依赖于细菌的生理状态，把细菌悬浮在电场中，短时间的通电能使细胞膜破损而令DNA进入细胞中去。

细菌间的基因转移

对于人和动物细胞来讲，引入外来基因的方法的采用要视细胞对象而不同。对于身体细胞来讲，用于微生物的方法也可以采用。此外还常用微粒子轰击法和微小囊体融合法。微粒子轰击法是将DNA吸附在钨或金的微粒上，通过特制的枪的轰击把DNA导入细胞。微小囊体融合法是将DNA包在人工制造的磷酯类微小囊体中，依赖于囊体与细胞的融合而把DNA输入细胞中去。

卵细胞体积大而数量少，所以常用显微注射方法引入DNA。显微注射当然是一种很费事的操作，不过现在某些实验室已采用电脑控制的自动化装置，应用这种装置每小时可注射1500个卵细胞。

植物细胞具有坚硬的细胞壁，所以一般在进行导入外来DNA操作以前先把它的细胞壁用溶解纤维素的酶处理，去除了细胞壁的细胞形成圆球状的原生质体。以上介绍的方法于是都可以应用于原生质体的悬浮液。在一定的条件下导入了外来基因的原生质体又可以形成细胞壁，甚至可以生长成植株。去除了细胞壁的植物细胞会发生融合。融合也可以发生在去除细胞壁的植物细胞与细菌细胞之间，通过这种融合可以把细菌细胞中所包含的运载着的基因直接导入植物细胞而毋须抽提它的质粒。当然方法各有利弊，例如最后一种方法似乎简便易行，可是在细胞融合过程中不需要的物质也将随着外来的基因同时进入细胞，这对以后的工作将会产生一些不利的影响。

外来基因的检出

无论哪一种导入DNA的方法都会带来接受外来DNA的细胞的死亡，在活下来的细胞中也总是只有一小部分真正接受了外来的DNA。因此必须有一种方法来检出这些细胞。

最常用的办法是用一个抗药性质粒作为基因载体。如果说质粒上有一个抗氯霉素基因，那么把经转化处理的细菌接种在含氯霉素的固体培养基上，在这上面长出来的菌落必然由含有这一质粒的细菌所长成。不过这样检出的细菌固然含有这一质粒，质粒上却未必运载着外来的基因，因为经过限制酶切的质粒可以通过自身的两个酶切末端的连接而成为不带有任何外来DNA的质粒，而这样的质粒同样可以通过转化进入细菌细胞而使它们对氯霉素具有抗性。

为了避免上述困难可以采用下面这一策略：选择一个具有两个抗药基因的质粒作为基因栽体，其中一个抗药基因的内部要求有某一限制酶的单一识别序列，利用这一识别序列来克隆外来基因，如果这里有外来的DNA插入便导致这一抗药基因的失活，因此可以从这一基因载体所给予细菌的另一种抗药性来检出带有外来基因的细胞。

在以上这2种方法中未接受外来基因的细胞应该是对这些药物呈敏感状态的；抗药性基因载体和敏感的受体细胞配成一对成为一个转化系统。按照同一原理可以用一个营养缺陷型细胞株系作为受体，用带有相应的野生型基因的质粒作为基因载体，在不加受体细胞所需的物质的培养基上生长的菌落都由接受了这一基因载体的受体细胞所长成；这里带有野生型基因的裁体和营养缺陷型株系配成一对，成为一个转化系统。