6.3 实践操作
6.3.1 PCR基因扩增
一、实验目的
通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。
二、实验原理
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93 ℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 ℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性—退火—延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
1.PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种，即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
（1）引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：
① 引物长度：15～30 bp，常用为20 bp左右。
② 引物扩增跨度：以200～500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10 kb的片段。
③ 引物碱基：G+C含量以40%～60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④ 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3′端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤ 引物3′端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥ 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦ 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1μmol或10～100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
（2）酶及其浓度：目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种是大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5 U（指总反应体积为100 μL），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减 少。
（3）dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCl的缓冲液将其pH调节至7.0～7.5，小量分装，－20 ℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200 μmol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（ 等物质的量配制），如其中任何一种浓度不同于其他几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
（4）模板（靶基因）核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其他细胞组分，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200 μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
2.PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
（1）温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性—退火—延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90 ℃～95 ℃变性，再迅速冷却至40 ℃～60 ℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70 ℃～75 ℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对较短靶基因（长度为100～300 bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94 ℃变性，65 ℃左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。
① 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93 ℃～94 ℃1min足以使模板DNA变性，若低于93 ℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。若此步不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
② 退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40 ℃～60 ℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55 ℃为选择最适宜退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值（解链温度）＝4（G＋C）＋2（A＋T）
复性温度＝Tm值－（5 ℃～10 ℃）
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60 sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③ 延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70 ℃～80 ℃ 150核苷酸/S/酶分子
70 ℃ 60核苷酸/S/酶分子
55 ℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90 ℃时，DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70 ℃～75 ℃，常用温度为72 ℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1 kb以内的DNA片段段，延伸时间1min是足够的。3～4 kb的靶序列需3～4min；扩增10 kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长 些。
（2）循环次数
循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数为30～40次，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增 多。
3.PCR反应特点
特异性强：
PCR反应的特异性决定因素为：
① 引物与模板DNA特异正确的结合；
② 碱基配对原则；
③ Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④ 靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高：
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg＝10－12 g）量级的起始待测模板扩增到微克（μg＝10－6 g）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速：
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性—退火—延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗漱液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检 测。
三、实验准备
1.仪器：PCR热循环仪、琼脂糖凝胶电泳系统。
2.材料：离心管、吸头、微量移液器。
3.试剂：
（1）DNA模版
（2）对应目的基因的特异引物
（3）10×PCR Buffer
（4）2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
（5）Taq酶
四、实验步骤
1.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5mL离心管中。
10×PCR buffer 2 μL
dNTPmix （2mM） 2 μL
引物1（10 pM） 1 μL
引物2（10 pM） 1 μL
Taq酶 （2 U/μL） 0.2 μL
DNA模板（50 ng—1 μg/μL） 1 μL
加ddH2O至 20 μL
视PCR仪有无热盖，不加或添加矿物油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93 ℃预变性3～5min，进入循环扩增阶段：93 ℃ 40 s → 58 ℃ 30 s → 72 ℃ 60 s，循环30～35次，最后在72 ℃ 保温7min。
3.结束反应，PCR产物放置于4 ℃待电泳检测或－20 ℃长期保存。
4.PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100 μL氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5～10 μL电泳检测。
五、注意事项
1.PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。
2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
3.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
4.PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22 μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
5.试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量贮存，从而确保实验与实验之间的连续性。
6.试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
7.PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
六、实验结果
1.紫外灯下观察电泳结果。
2.分析所得到的结果。
6.3.2 载体构建
一、实验目的
通过本实验学会重组DNA连接以及鉴定重组质粒的方法。
二、实验原理
外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA 5′磷酸和相邻的3′羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5′磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。如果质粒DNA已去磷酸化，则能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂体导入感受态细胞后可被修复。相邻的5′磷酸和3′羟基磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。实际上在技术克隆中，T4噬菌体DNA连接酶是首选的酶。这是因为在下述反应条件下，它就能有效地将平端DNA片段连接起 来。
DNA一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速率完全由互相匹配的DNA末端的浓度决定。无论末端位于同一DNA分子（分子内连接）还是位于不同DNA分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种DNA，也就是用可产生黏端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体DNA。如果反应中DNA浓度低，则配对的两个末端在同一DNA分子上的机会较大（因为DNA分子的一个末端找到同一分子的另一个末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率）。这样，在DNA浓度低时，质粒DNA浓度高时，连接反应的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒外，还含有带匹配末端的外源DNA片段。对一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响，而且还收到质粒和外源DNA末端的相对浓度的影响。涉及带黏端的线状磷酸化质粒DNA的连接反应应包 含：
1.足量的载体DNA
对一个pUC18一般大小的质粒，连接反应中应含有载体DNA为20～60 μg/mL。
2.末端浓度等于或高于载体DNA的外源DNA
如外源DNA浓度比载体多，有效连接产物的数量会很低，这样就很难区别小部分带重组质粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒DNA以便通过定向克隆的方法构建重组质 粒。
重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选时最常规的一种鉴定方法。是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。线状使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，成为α-互补。由α-互补而产生的LacZ细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化后，菌平板37 ℃温箱倒置培养12～16小时后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
三、实验准备
1.仪器：恒温摇床、水浴锅、培养箱、离心机、超净工作台。
2.材料：LB固体、液体培养基、抗生素、内切酶、T4连接酶、质粒、培养皿、接种针、玻璃涂布棒、酒精灯、试管、大肠杆菌感受态细胞。
3.试剂：IPTG：取2 g IPTG溶于8mL超纯水中，再补足至10mL，用0.22 μm滤膜过滤除菌后分装储存于－20 ℃；X-gal：将X-gal溶于二甲基甲酰胺，配制成20mg/mL，避光储存于－20 ℃。
四、实验步骤
1.基因的获得
2.回收
A.酶切回收：一般做50～100 μL 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30 μL。
B.PCR回收：一般做总体系为100—200 μL的PCR量（用高保真酶：如PFU酶、KOD PLUS酶），分成约50 μL/管，然后上PCR仪。→跑电泳回收，约30 μL。→酶切回收，做100 μL体系，→直接过回收柱回收DNA片段。
3.连接：连接体系总量一般为10—20 μL。12 ℃—16 ℃ 过夜。
4.转化：一般转化DH5α感受态，10—15 μL 连接液转化至50 μL感受态中→冰浴1 h→热休克42 ℃ 90 s→冰浴5min→加1000 μL LB液，37 ℃ 振摇1 h。铺相应抗性的平板。置37 ℃孵箱，培养12 h。
5.挑克隆：从平板上挑取数个克隆，于相应抗性的LB中，37 ℃培养12 h。
6.抽提质粒：手工抽提质粒，一般溶于30 μL TE或EB。
7.鉴定
A.酶切鉴定：一般用什么酶装上的，就用什么酶鉴定。但原则是选用相对便宜的酶。选择原来载体上没有而基因上有的酶切位点与载体上另一酶切位点共同鉴定。一般鉴定选择2～4组酶，来确定构建的载体是否正确。
B.PCR鉴定：一般扩增目的条带。也可扩增载体和目的条带连接处的片段。
