5.3 实践操作
5.3.1 大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化
一、实验目的
1.学习大肠杆菌转化的基本原理。
2.掌握氯化钙转化法的基本程序。
二、实验原理
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移至新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化（transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含有限制性内切酶和甲基化酶的突变体，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊的方法（如电击法、氯化钙等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（competent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（transformant）即带有异源DNA分子的受体细胞。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法和电击法，电击法制备的感受态细胞转化效率较高，但需要电转化仪。而CaCl2法简单易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求。制备出感受态细胞暂时不用时，可加入占体积15%的无菌甘油于－70 ℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
为了提高效率，实验中要考虑以下几个因素：
1.细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储存于4℃的培养菌，最好从－70 ℃或－20 ℃甘油保存的菌种直接活化，用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过检测培养液的OD600来控制。DH5α菌种的OD600为0.5时，细胞密度在5×107 CFU/ml左右（不同的菌种情况有所不同），这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
2.质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA（cccDNA）。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50 μL的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。
3.试剂的质量：所有的试剂，如CaCl2等均需是高纯度的（GR.或AR.），并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
4.防止杂菌的杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管和枪头等最好是新的，并经过高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或造成杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温，实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因（AmpR），可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子经扩增后，可提取质粒DNA，进行酶切、电泳等进一步鉴 定。
三、实验准备
1.材料
E.coli DH5α菌株、质粒pBluescript DNA（pBS DNA）。
2.试剂
（1）LB固体和液体培养基。
（2）Amp母液：100mg/mL。
（3）0.05mol/L的CaCl2溶液：称取0.28 g CaCl2（无水，分析纯），溶于50mL超纯水中，定容至100mL，高压灭菌。
（4）含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液：称取0.28 g CaCl2（无水，分析纯），溶于50mL超纯水中，加入15mL甘油，定容至100mL，高压灭菌。
3.器具
恒温摇床、培养箱、台式高速离心机、超净工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、微量移液器及吸头、无菌离心管。
四、实验步骤（分组：每个小组5～7位学生）
1.感受态细胞的制备
（1）从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37 ℃下振荡培养12 h左右，直至对数生长后期（教师做）。
（2）将该菌悬液以1 ：50的比例重新接种于5mL LB液体培养基中（2组），37 ℃振荡培养2～3小时至OD600＝0.5左右。
（3）将5mL培养液转入3支1.5mL离心管中，冰上放置10分钟，然后于4 ℃下5000 rpm离心5min（每组3支）。
（4）弃去上层清液，在每支离心管中用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液1mL轻轻悬浮细胞，冰上放置15分钟后，4 ℃下5000 rpm离心5分钟。
（5）弃去上层清液加入0.2mL预冷的0.05mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，即制成感受态细胞。将感受态细胞悬液分装成2份，每份100 μL（注意悬液密度要均匀）。冰上放置备用（每组有6份感受态细胞）。
2.铺平板
将配好灭菌的LB固体培养基加热溶化，待冷却至60 ℃左右，加入氨苄青霉素储存液，使终浓度为100 μg/mL，摇匀后铺板，每皿倒约15mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。
3.感受态细胞的转化
（1）将100 μL感受态细胞悬浮液，置冰上5min，然后加入pBS质粒DNA溶液（含量不超过50 ng，体积不超过10 μL），轻轻摇匀，冰上放置30min（每组做2份）。
（2）42 ℃水浴中热击90 s，热击后迅速置于冰上冷却3～5分钟。
（3）向管中加入1000 μL LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37 ℃振荡培养1 h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
（4）将上述1000 μL菌液中取出200 μL涂布于1块含卡那霉素的筛选平板上，正面向上放置0.5 h，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37 ℃培养16～24 h。（每组2块平板）
（5）同时做两个对照
对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其他操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，取5 μL菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
（6）计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积
转化频率（转化子数/每mg质粒DNA）＝转化子总数/质粒DNA加入量（mg）
感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积
感受态细胞转化效率＝转化子总数/感受态细胞总数
五、记录转化后每个培养皿中菌落形成情况，计算转化率。
六、思考题：制备感受态细胞的原理是什么？如果试验中对照组不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？
5.3.2 大肠杆菌质粒DNA的制备及酶切鉴定
一、实验目的
1.掌握质粒的小量快速提取法。
2.了解质粒酶切鉴定的原理及方法。
二、实验原理
质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～200 kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。质粒DNA可独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能存活，且它控制的许多生物学功能赋予宿主细胞某些表 型。
通过小量制备的方法可从大量克隆中快速制备质粒DNA。碱裂解法是最常用的小量制备质粒DNA的方法。所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）可使细胞壁裂解，经两者处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易发生沉淀，而质粒DNA则留在上层清液中。用酒精洗涤沉淀，可得到质粒DNA。
质粒DNA相对分子质量一般在106～107范围内。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）通常以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环（open circular DNA，ocDNA）。在电泳时，同一质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区 带。
限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和序列的DNA片段。例如，EcoR I和Hind III的识别序列和切口是
EcoR I：G↓AATTC
Hind III：A↓AGCTT
G、A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的条带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子质量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
三、实验准备
1.材料
带质粒pBluescript的大肠杆菌DH5α、DNAmarker、限制性酶EcoR I和Hind III及缓冲 液。
2.试剂
（1）溶液Ⅰ：50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl（pH 8.0）、10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5mL，0.5M EDTA（pH 8.0）10mL，葡萄糖4.730 g，加ddH2O至500mL。在121 ℃高压灭菌15min ，贮存于4 ℃。
（2）溶液Ⅱ：0.2N NaOH、1% SDS。配制方法：2N NaOH 1mL，10%SDS 1mL，加ddH2O至10mL。使用前临时配制。
（3）溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。配置方法：5M KAc 300mL，冰醋酸 57.5mL，加ddH2O至500mL。4 ℃保存备用。
（4）TE：10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1mL，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2mL，加ddH2O至100mL。121 ℃高压湿热灭菌20min，4 ℃保存备用。
（5）苯酚/氯仿/异戊醇（25 ：24 ：1）。
（6）乙醇（无水乙醇、70%乙醇）。
（7）5×TBE。配制方法：Tris 碱54 g，硼酸27.5 g，EDTA-Na2·2H2O 4.65 g，加dd H2O至1000mL。121 ℃高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
（8）溴化乙锭（EB）：10mg/mL。
（9）RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶（DNase-free） RNase A的10mg/mL，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于－20 ℃。
（10）6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
（11）1%琼脂糖凝胶：称取1 g琼脂糖于三角烧瓶中，加100mL 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60 ℃左右，加EB母液（10mg/mL）至终浓度0.5 μg/mL（注意：EB为强诱变剂，操作时戴手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，不能有气泡产生，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。
3.器具
塑料微量离心管、移液枪及吸头、台式高速离心机、水平电泳仪、水浴锅、凝胶成像系统、恒温振荡培养箱、微波炉。
四、实验步骤
1.质粒DNA的小量提取
（1）挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0mL LB（含相应抗生素）液体培养基中，37 ℃、250 g振荡培养过夜（约12～14 h）。
（2）取1.5mL培养物于微量离心管中，室温离心8000 g×1min，弃上层清液，将离心管倒置，使液体尽可能流 尽。
（3）将细菌沉淀重悬于100 μL预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。
（4）加200 μL新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2～3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
（5）加入150 μL预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3～5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
（6）4 ℃离心12000 g×5min，将上层清液转移至另一离心管中。
（7）加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4 ℃离心12000 g × 10min。
（8）小心移出上层清液于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2～5min，4 ℃离心12000 g×15min。
（9）加入1mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀1～2次，4 ℃离心8000 g×7min，弃上层清液，将沉淀在室温下晾干。
（10）沉淀溶于20 μL TE（含RNase A 20 μg/mL），37 ℃水浴30min以降解RNA分子，－20 ℃保存备用。
2.质粒DNA的酶解
将离心管编号后放在冰浴上，按要求依次加入dd H2O、缓冲液、DNA及限制酶，使终体积为10 μL。混匀后稍离心，37 ℃保温2～3 h。
3.DNA琼脂糖凝胶电泳
（1）制备1.0%的琼脂糖凝胶。
（2）取适量酶切反应液，加入上样缓冲液后，用小枪头加入胶板的样品小槽内。
（3）120 V电压，电泳约0.5 h，当指示剂移动至距离胶板1～2 cm处，停止电泳。
（4）将电泳后的胶板在凝胶成像系统中观察DNA条带，并拍照。
五、实验记录与思考
1.拍摄电泳图，并标注每个泳道样品的名称，根据相对分子质量标记估算DNA条带的相对分子质量大小。
2.思考题：染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？