3.3.1　大肠杆菌的培养

一、实验目的

1.掌握细菌培养及菌株保存的基本方法。

2.学习细菌生长监测的方法。

二、实验原理

大肠杆菌是一种含有长约300 kb的环状染色体的棒状细菌，能在仅含碳水化合物如葡萄糖（提供碳源和能量）和提供氮、磷和微量元素的无机盐的极限培养基上快速生长。如果用含有氨基酸、核苷酸前体，维生素及其他一些细菌不能合成的代谢成分的丰富培养基来培养，则生长更快。

当大肠杆菌在平板上生长时，细胞固定在琼脂上，所有子代细胞聚在一起，形成菌落。当聚集的细胞超过107个时，肉眼能观察到一个菌落。如果初始样品中含很少的细胞时，每一独立的菌落来源于单一遗传祖先的起始细胞，称为一个克隆。

少量液体培养物可加样在琼脂培养基上，用无菌的涂布棒使之均匀分散在培养基表面，这一过程称涂布（plating）。在液体培养基中培养时，大肠杆菌细胞在开始裂殖前，先进入一个生长滞后期。在丰富培养基中，它能在20～30分钟内复制一代，这种指数生长称为对数期。最后，当培养基中营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值。在通常的实验室培养中，在这一时间的细胞密度为1×109～2×109 CFU/ml，细胞停止迅速分裂。这就是细菌生长的饱和期，而所谓的新鲜饱和即是指培养液中细胞密度刚达到这一水平。

野生型细菌称原养型，能在含有无机盐、碳源、水的基本培养基上生长。突变的克隆不能在基本培养基上生长，而只能在添加一种或多种特殊营养物质（如腺嘌呤、苏氨酸或生物素）的培养基上生长，因此能通过筛选得到营养缺陷型。此外，野生型菌株对某些抑制剂敏感，如链霉素，而抗生素能在含有抑制物的培养基上生长，这些特性使遗传学家能从平板克隆中区分不同表现型的突变株。对于很多特性，克隆的表型可容易地通过目测或简单的生化检测加以观察。

三、实验准备

1.材料：E.coli DH5α

2.试剂：

（1）LB液体和固体培养基

（2）甘油或二甲基亚砜（DMSO）

3.器具：

（1）接种环

灭菌：将接种环置于酒精灯火焰中灼烧至变红。

冷却：将接种环触碰无菌琼脂平板表面至其不发出“咝咝”声。

（2）无菌牙签

将牙签装在锡箔纸加盖的烧杯或盒子中高温高压灭菌。

（3）涂布棒

加热并弯曲一支直径为4mm的玻璃管或巴斯德吸管制备涂布棒；将涂布棒的三角部分浸没于酒精中，从容器中取出后再通过灯焰，点燃其上的乙醇；待涂布棒上的火焰熄灭后，将其触碰无菌琼脂的表面使其冷却。

（4）细菌培养用的试管、平皿、恒温培养箱、分光光度计、微量移液枪及枪头 等。

四、实验步骤

1.液体培养基

（1）过夜培养

a）取5mL液体培养基加入一支无菌的16mm或18mm的培养试管中。

b）用接种环挑一个单菌落，浸没于培养液中并轻轻振动接种环，使接种环上的细菌分散在培养液中。

c）盖好试管，在摇床上以180 rpm速度，于37 ℃培养至饱和（约6 h）。

（2）大量培养

a）按1 ：100的比例将过夜培养物加入一个无菌烧瓶中，烧瓶体积应该是培养液体的5倍以上。

b）于37 ℃摇床，约200 rpm速度剧烈振荡培养。

（3）细菌培养的检测

a）利用计数板检测

用一片干净的盖玻片盖住一片干净的计数板玻片，用含少量培养液的吸管接触盖玻片的边缘，在显微镜下观察，并且按一个小方块中所见的每个细菌大约相当于2×107 CFU/ml计算细菌浓度。

b）利用分光光度计检测

稀释培养液至OD600<1，按每0.1OD值约相当于108 CFU/ml计算细菌浓度。

2.固体培养基上培养

（1）通过连续稀释法分离细菌菌落

a）在3支无菌培养试管中各加入5mL LB培养液，并标上序号1、2、3。吸取5 μL细菌培养液加入1号试管中振荡摇匀，接着从1号试管中吸取5 μL稀释液加入2号试管中振荡摇匀，再从2号试管中吸5 μL稀释液加入3号试管振荡摇匀，每次都使用新的吸头。

b）从每支试管中分别取100 μL菌液涂布于LB平板上，并且做好记号，待平板干后于37 ℃培养过 夜。

c）计算每毫升细菌细胞数：细菌细胞数/mL＝10×菌落数×稀释倍数。

d）包裹好平板保存于4 ℃以备进一步实验用。

（2）通过平板画线法分离单菌落

采用无菌操作技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始画线。重新消毒接种环，从第一画线处将样品画线至平板的其余部分，重新画线至平板的其余部分，重复画线直至覆盖整个平板。于37 ℃培养至长出单菌 落。

（3）通过铺平板分离单菌落

吸取0.05～1mL培养物至一个干的平板。用涂布棒做圆周运动将培养液涂抹均匀，或将涂布棒的边缘在平板表面画一系列平行线，然后转动平板并于已涂布的平行线成直角重复涂布。

3.菌株的冷冻保存与复壮

（1）将0.85mL的中期培养液加入一个装有0.15mL无菌甘油的微量离心管，振荡培养物，使甘油均匀分布。

（2）保存于－20 ℃或－70 ℃。

（3）复苏时，用无菌牙签或吸管刮取固体冰渣子（仔细操作不要让其融化），然后在LB平板上画 线。

五、实验记录与思考

比较大肠杆菌、农杆菌和酵母三者的生长速度和菌落形态等方面的差异。

3.3.2　细菌的革兰氏染色

一、目的要求

1.了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类中的重要性。

2.学习并掌握革兰氏染色技术。

3.进一步巩固显微镜的实验技术。

二、基本原理

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫—碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫—碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

三、器材

未知细菌；革兰氏染色液；载玻片；显微镜；接种针；酒精灯。

四、操作步骤

1.涂片

将培养14～16小时的细菌涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2.染色

（1）初染　加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。

（2）媒染　滴加碘液覆盖约一分钟，水洗。

（3）脱色　将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即用水冲净酒精。

（4）复染　用番红液染1～2分钟，水洗。

（5）镜检　干燥后，置显微镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反 应。

五、实验报告

1.结果

在你所作的革兰氏染色制片中，细菌染成何种颜色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？请画出你所观察的细菌形态。

2.思考题

（1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？

（2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确、结果可 靠？