实验七 环境条件对微生物生长的影响
一 目的要求
1、了解生物因素（抗生素）对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的作用
2、掌握抗菌谱实验的基本方法
3、理解常用化学消毒剂对微生物的作用
4、掌握纸片法测定化学消毒剂抗菌作用的基本方法
二 实验原理
微生物的生长繁殖受外界环境的影响，环境条件适宜时微生物生长良好，环境条件不适宜时，微生物生长受到抑制，甚至导致微生物死亡。物理，化学，生物及营养等不同环境因素影响微生物生长繁殖机制不尽相同，而不同类型微生物对同一环境因素的适应能力也有差异。
1.生物因素
抗生素是某些植物与微生物生长到对数期前后所产生的次生代谢产物，其在低浓度下可其它微生物生长具抑制作用或杀死作用的物质。抗生素对敏感微生物的作用机理分为抑制细胞壁的形成、破坏细胞膜的功能、干扰蛋白质合成及阻碍核酸的合成。
由于不同微生物对不同抗生素的敏感性不一样，抗生素的作用对象就有一定的范围，这种作用范围成为抗生素的抗菌谱。每种抗生素都有它固定的抗菌范围和抗菌谱，例如青霉素只对革兰氏阳性菌具有抗菌作用，多粘菌素只对革兰氏阴性菌有作用，这类抗生素称为窄谱抗生素；另一些抗生素对多种细菌具有作用，例如四环素、土霉素对许多革兰氏阳性菌和阴性菌都有作用称为广谱抗生素。
当某种抗生素长时间用于敏感微生物生长后，即使同一种菌的不同菌株对不同药物的敏感性也常发生改变，甚至出现耐药菌株，亦即产生抗性菌株，则抗生素将失去对抗性菌株生长的抵制，只以采用新的抗生素才可能控制抗性菌株的生长与繁殖，因而不断开发新的抗生素是保健人类身体健康的重要工作。新抗生素产生菌的分离筛选应通过拮抗菌发酵，然后以发酵产物进行抗菌活性实验，根据实验结果而获得产新抗生素的菌株。微生物代谢产物的抗菌活性常以管碟法与纸片法进行检测，根据透明抑菌圈的有无与大小作为依据。
2.化学消毒剂
常用化学消毒剂包括（酚、醇、醛等）、重金属盐、卤素元素及其化合物、染料（龙胆紫）和表面活性剂等。（5%石碳酸、1%来苏尔、75%乙醇、0.25%新洁尔灭）
三 实验器材
1、菌种 金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。
2、培养基 牛肉膏蛋白胨培养基。
3、试剂和材料 无菌滤纸片（条）、镊子，接种环，酒精灯、头孢、酒精、龙胆紫、汞溴红等。
四 方法步骤
（一）生物因素（抗生素）对微生物生长的影响
①倒平板：将牛肉膏蛋白胨培养基溶化后倒平板，注意平皿中培养及厚度均匀。
②贴滤纸条：无菌操作，用镊子取无菌滤纸条进入青霉素溶液湿润，在容器内壁沥去多余溶液，再将滤纸条分别贴在平板上。
③接种：无菌操作，用接种环分别取金黄色葡萄球菌、土壤分离细菌B1,土壤分离细菌B2，从滤纸条边缘分别垂直向外划线接种（划线尽量靠近滤纸条，但不要接触）
④培养、观察：置于37℃保温培养1d，观察细菌生长状况并记录。
（二）化学消毒剂对微生物的影响
①菌液制备：无菌操作将金黄色葡萄球菌菌接种至装有5mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中，37℃培养18h。（实验室老师已准备，此步骤不用做）
②倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，注意平皿中培养基厚度均匀，倒3套平板。（平板厚度均匀，滤纸片大小一致）
③涂平板：无菌操作吸取0.2mL金黄色葡萄球菌菌液加入上述平板，用无菌三角涂棒涂布均匀。
④标记：将上述平板皿底用记号笔分成四等分，分别标明一种消毒剂名称
⑤贴滤纸片：无菌操作，用镊子取无菌滤纸片分别浸入各种消毒剂，在容器内壁沥去多余液体，再将滤纸片分别贴在平板上相应位置。（不要在培养基表面拖动滤纸片）
⑥培养，观察：将上述平板倒置于37℃保温培养1d，观察并记录抑（杀）菌圈大小。
注意事项：
（1）制备平板厚度均匀，滤纸条形状要规则，不要在培养基表面拖动滤纸条，避免抗生素溶液不均匀扩散；
（2）划线接种应尽量靠近滤纸条，但不要接触，以免接种环将滤纸条上的抗生素带动到其他部位；
（3）无菌操作必须严格，避免将不同菌种混杂；
（4）滤纸片大小一致，涂布后的平板在室温下干燥3~5min，用无菌镊子将纸片贴于琼脂表面并轻压，使纸片与琼脂表面完成接触。各纸片中心相距应大于24mm，纸片贴上后就不能再移动位置；
（5）涂布要均匀，是细菌均匀分散；
（6）消毒剂名称标记清楚，避免混乱；
（7）将平板倒置放入培养箱。
