模块二：基础微生物学操作技术
教学目标：
①掌握配制微生物培养基的方法；
②掌握试管、三角瓶和培养皿的包扎方法；
③掌握灭菌的基本原理和操作技术；
④掌握微生物稀释涂布分离技术、平板划线分离技术；
⑤树立无菌意识和掌握无菌操作方法。
实验项目：
实验5 培养基的配制和灭菌
实验6 微生物的纯种分离、培养和接种技术
实验7 环境条件对微生物生长的影响
实验6涉及到的实验内容包括：无菌操作、倒平板、梯度稀释、平板涂布和平板划线分离，内容知识点较多，请务必提请充分预习，查看相关操作视频
实验六土壤微生物的稀释分离、纯化及无菌操作技术
一、实验目的和内容
（一）实验目的
1．学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术；
2．掌握微生物样品稀释法和涂布平板法分离微生物的操作技术；
3．初步掌握无菌操作技术和平板菌落计数法。
（二）实验内容
1．用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌。
2．用平板划线法分离微生物。
二、实验原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程成为微生物的分离与纯化。常用的分离纯化方法有：单细胞挑取法、平板划线法和稀释倒平板法。本实验利用稀释倒平板法从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌。基本原理为：将含有各种微生物的土壤悬液进行稀释后涂布接种到各种选择培养基平板上，在不同条件下培养，从而使各类微生物在各自的培养基上形成单菌落。单菌落是由一个细胞繁殖而成的集合体，即是一个纯培养。
1. 什么是微生物的纯培养，从固体培养基中分离微生物的方法有哪些?
2. 为什么可以根据菌落数目来计算样品中微生物的数量?
三、实验材料和用具
1．土壤样品：有目的地取某一类型的土壤。
2. 培养基
巳灭菌的牛肉膏、高氏1号、PDA固体培养基。
3. 试剂及仪器
无菌水(带玻璃珠)、灭过菌的塑料管及枪头、。无菌培养皿、土壤样品、天平、称量纸、药勺、试管架、涂布器。
四、操作步骤
（一）土壤稀释分离细菌、放线菌和霉菌
1．取土壤
取表层以下5-10 cm处的土样．放入灭菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。
2．无菌操作制备土壤稀释液
（1）制备土壤悬液：称土样1 g，迅速倒入带玻璃珠的无菌水瓶中(90mL，玻璃珠用量以充满瓶底为最好)，振荡5-10 min使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。
图4-1 稀释法分离土壤微生物操作过程
(2) 稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5 mL．放入4.5 mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3-10-8的稀释液(图2-1)。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用1支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于一次，以减少稀释中的误差。
3．涂布法测定菌落数的方法
（1）倒平板
按无菌操作要求，在火焰旁操作(图2-2)，取融化并冷却至不烫手的固体培养基(约50℃)，倒入无菌培养皿中，倒量以铺满皿底为限，平放桌上待其充分凝固，备用。
图4-2 倒平板的方法 图4-3 平板涂布菌
（2）接种量和培养基
细菌：取10-5、10-6、10-7两管稀释液各0.10 mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接入两个牛肉膏琼脂平板中，涂布均匀。
放线菌：取10-3、10-4、10-5两管稀释液，在每管中加入10％酚液5-6滴，摇匀，静置片刻，然后分别从两管中吸出0.2 mL加入相应高氏1号培养基平皿中，涂布均匀。
霉菌：取10-2、10-3、10-4两管稀释液各0.2 mL，分别接入相应的PDA培养基中（每100 mL加入灭菌的乳酸1 mL），涂布均匀。
（3）培养
将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28-30℃恒温培养，细菌培养1-2 d，放线菌培养5-7 d，霉菌培养3-5 d可用于观察菌落，用于进一步分离纯化或直接转接斜面。
（二）平板划线分离微生物
1．划线分离
使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种（本实验为10-2）中沾取少量菌样．在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落，主要方法参见下图。
3．培养方法同“土壤稀释分离”。
分别做好标记(写上菌名、日期、操作人等)
Tips：操作要点包括倒平板、梯度稀释、平板，最终计算出土壤中微生物的浓度。
实验原理、过程介绍：
操作分解-倒平板
操作分解-梯度稀释
操作分解-平板涂布
微生物浓度计算方法：
选择长出菌落数30-300之间的培养皿进行计数, 按以下公式：
总菌数/g＝同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数
