一、组织学的内容和意义

   组织学（histology）：研究机体正常的微细结构及其相关功能的科学，包括细胞、组织、器官和系统。

    机体的组织是由细胞和细胞外基质构成，器官是由几种不同的组织构成，系统则是由功能相关的器官组成。所以组织学的研究内容包括:细胞、组织、器官和系统。

1、细胞(cell): 是人体形态结构的基本单位，是一切生物体新陈代谢、生长发育、繁殖分化的形态学基础。细胞的结构特点:人体具有多种(210多种)形态各异、大小不等的细胞。功能特点:执行着多样的机能活动。它们在身体内互相调节和互相合作，以维持整体的生命活动。 

2、组织(tissue): 在胚胎发育时期形成。由一些形态相似、功能相近的细胞和细胞外基质(细胞间质)所组成。由于细胞的种类和特性不同，组织也相应分为:上皮组织、结缔组织、肌组织和神经组织。

3、器官和系统: 几种不同的组织发育、分化并互相结合形成了器官，执行一定的功能。功能相关的器官构成系统，完成一系列相关的功能活动。

 研究水平：组织、细胞、亚细胞、分子。

      随着现代科学技术的发展, 组织学的研究已从光镜和电镜水平深入到分子水平, 并与分子生物学、生理学、生物化学、免疫学和病理学等学科交叉, 形成现代医学研究的一些重大课题, 如精准医学与肿瘤生物治疗、干细胞治疗与再生医学、细胞死亡与衰老、3D打印与组织工程等。作为一名医学生只有系统掌握组织学与胚胎学知识, 才能更好地学习和理解人体的生理过程和病理现象, 为深入学习其他医学基础和临床课程奠定坚实的基础。

组织学伴随着显微镜的发明而建立，显微镜的改进升级和标本制备技术的进步推动着组织学和胚胎学的不断发展。光学显微镜的分辨率约为0.2um，可使物体放大几十倍至1000倍,能配察到细胞水平的光镜结构。普通透射电子显微镜的分辨率则提高到0.2nm，放大率为几千倍到几万倍，能观察到亚细胞水平的超微结构。

    用光学显微镜与电子显微镜观察标本时,常用的长度计量单位及其之间的换算为:

    lmm(毫米)=1000um(微米)

       lum(微米)=1000nm(纳米)

    Inm(纳米)=1000pm(皮米)

    随着技术进步、新方法的不断涌现,必将有力地推动组织学与胚胎学进一步发展。下面就常用的显微镜和样品制备技术作简要介绍。

       一、光学显微镜技术

    应用一般光学显微镜(简称光镜)观察组织切片是组织学研究最基本的方法。 通常光镜可放大1000倍左右,分辨率为0.2um。 光镜观察的石蜡包埋组织切片通过取材、固定、石蜡包埋、切片、脱蜡、染色、透明等步骤制成。 组织学中最常用的是苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色法,简称HE染色法(图1-1)。 苏木精是碱性染料,能将细胞核染成蓝紫色；伊红是酸性染料,能将细胞质染成红色。对碱性染料亲合力强者,称嗜碱性(basophilia),对酸性染料亲合力强者,称嗜酸性(acidophilia)。若与两种染料的亲合力均不强者,称中性(neutrophilia)。

               图1-1  肝脏切面光镜像    HE染色（↑细胞核；★细胞质）

   此外,还有利用物理吸附作用的染色方法,如用苏丹染料显示脂肪组织,染料溶于脂肪内,使细胞内的脂滴显色。而用硝酸银、氯化金等重金属盐显示细胞和组织的某些结构,则是使金属微粒附着在结构表面而呈棕黑色或棕黄色。银染法中有些组织结构可直接使硝酸银还原而显示,称此为亲银性(argentaffin)(图1-2)；有些结构无直接还原作用,需加人还原剂方能显色,则称为嗜银性(argyrophilia)还有些组织成分如结缔组织和软骨基质中的氨基聚糖，当用甲苯胺蓝(toluidine blue)等碱性染料染色后呈紫红色，这种现象称为异染性(图1-3)。

                       图1-2  淋巴结切面光镜像    镀银染色

                     图1-3  肥大细胞光镜像    甲苯胺蓝染色（异染性）

     以上方法制备的标本一般是用普通光镜进行观察。

     在组织化学术，常使用荧光染料染色或作为标记物，用荧光显微镜(fluorescence microscope)观察(图1-4)。荧光显微镜以紫外线为光源，能激发染料发出荧光。在细胞培养术，一般光镜不易分辨无色透明的活细胞,须用相差显微镜(phase contrast microscope)才能观察。相差显微镜可将活细胞不同厚度及细胞内各种结构对光产生的不同折射,转换为光密度差异(明暗差)，从而使镜下结构反差明显,影像清晰(图1-5)。

    激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal mieroscopy，LSCM)是在荧光显微镜的基础上加装了激光共轭聚焦逐层扫描装置,利用计算机进行图像处理,从而得到细胞或组织内部微细结构的普通光或荧光图像。相对于普通显微镜技术，它可对较厚的组织切片进行连续精确的断层扫描,获得组织内各个层面的精细图像,然后经计算机合成处理后,形成完整的三维图像。它也有利于用激光激发荧光，其激发光强度可精确控制，荧光检测快，对细胞损伤小，具有良好的可重复性。 此技术除可观察固定的组织外，还可动态观察体外培养的活细胞；能对细胞内分子或离子进行标记,检测各种物质的表达及其动态变化；图像数据可及时输出和长期储存。另外,近年出现的双光子显微镜(two-photon microscope)则结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术,可用于观察更厚的标本,对活细胞的损伤更小，成像的立体感更强。

                             图1-4 成纤维细胞银光染色

                           图1-5 相差显微镜观察培养的活细胞

    二、电镜技术

    与一般光镜相比，电镜用电子束代替可见光，用电磁透镜代替光学透镜，用荧光屏使肉眼不可见 的电子束成像。

    1. 透射电镜术(transmission electron microscopy, TEM) 因用电子束穿透样品、产生物像而得名。由于电子易被散射或被样品吸收, 故穿透力低，须制备超薄切片(50～80nm)。取材要尽量新鲜，以保存细胞正常的超微结构。组织块(1mm3以内)用戊二醛与锇酸两次固定， 脱水后树脂包埋，用超薄切片机切片，再经醋酸铀和柠檬酸铅染色。电子束射落到切片时, 随细胞构成成分的密度以及吸附重金属铀、铅、锇的程度不同，而发生相应的电子散射。当电子束投射到密度大、吸附重金属多的结构(如溶酶体)时，电子被散射的多，因此，射落到荧光屏上的电子少而呈暗像，电镜照片上呈黑或深灰色，称该结构为高电子密度(electron-density)；反之呈浅灰色，称低电子密度。透射电镜 的分辨率可达到0. 2nm。

    2. 扫描电镜术(scanning electron microscopy, SEM) 取材要求同透射电镜，组织块用戊二醛和锇酸固定后，经脱水、干燥， 再于其表面喷镀薄层金膜。观察时，电镜发射极细的电子束在标本表面扫描，标本表面散射的电子(称二次电子)被探测器收集，形成电信号传送到显像管，在荧光屏上显示标本表面的立体构像。用扫描电镜能观察较大的组织表面, 因其景深长, 凹凸不平的结构也能清晰成像，故图像具有立体感。扫描电镜的分辨率为2nm。

    三、组织化学术

    组织化学术(histochemistry)为应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物学的原理和技术，与组织学技术相结合而产生的技术，能在组织切片定性、定位地显示某种物质的存在与否、以及分布状态。还可进一步用显微分光光度计或图像分析仪测定切片中该物质反应的强度, 获得定量的信息。应用这种技术于游离细胞的样品(如细胞涂片), 则称细胞化学术(cytochemistry)。

    1. 一般组织化学术 基本原理是在切片上加某种试剂, 与组织中的待检物质发生化学反应, 其最终产物为有色沉淀物或重金属沉淀, 以便用显微镜观察。如显示糖类, 常用过碘酸希夫反应(periodic acid Schiff reaction，PAS反应)显示聚糖和糖蛋白的糖链。糖被强氧化剂过碘酸氧化后，形成多醛；后者再与无色的品红硫酸复合物(即希夫试剂)结合，形成紫红色反应产物(图1-6)。

            图1-6 小肠光镜像 （PAS反应小肠上皮杯状细胞的黏原颗粒呈红色）

    2.免疫组织化学术( immunohistochemistry) 是根据抗原与抗体特异性结合的原理，检测组织中肽和蛋白质的技术。肽和蛋白质均具有抗原性。当把人或动物的某种肽或蛋白质作为抗原注入另种动物，其体内会产生针对该抗原的特异性抗体(免疫球蛋白)。将抗体从动物血清中提出后，与标记物相结合，即成为标记抗体。用后者与组织切片或细胞涂片孵育，抗体则与其中的相应抗原特异性结合，在显微镜下通过观察标记物而获知该肽或蛋白质的分布部位。常用标记物有荧光素和辣根过氧化物酶（图1-7 、 图1-8）。

                        图1-7 免疫组织化学术原理示意图

                       图1-8 免疫组织化学术ABC染色，棕色为阳性反应

3.原位杂交术（(in situ hybridization）即核酸分子杂交组织化学术。原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将带有标记物的已知碱基序列(即核酸探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA片段或RNA，进行特异性原位结合，形成成专一的核酸杂交分子，再经一定的检测手段，对标记物进行显示，从而获知待测核算的有无及相对量（图1-9 ）。

               图1-9 原位杂交显示大鼠主动脉平滑肌细胞呈弹性蛋白mRNA阳性

一 、组织学发展简史

      1665年英国物理学家Robert Hooke 用显微镜观察软木塞薄片,首先描述了细胞壁构成的小室，称之为“Cell”(Cell一词是由中世纪拉丁语“Cella”演变而来,原意是“小室”)。1677年荷兰科学家Antoni van Leeuwenhoek 用高倍显微镜发现了精子、红细胞、肌细胞和神经细胞等。1801年法国人Bichat 观察解剖后的组织，首次提出“组织"(法文tissu)一词。德国学者Schleiden和Schwann于1838年和1839年分别指出细胞是一切植物和动物的结构、功能和发生的基本单位,创立了细胞学说，在组织学与胚胎学等生命科学发展史上具有十分重要的意义。

    19世纪中期以后,随着光学显微镜、切片技术及染色方法的不断改进与充实,推进了组织学的继续发展。20 世纪初至中期,陆续制成相差显微镜、偏光显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜和紫外光显微镜等特殊显微镜，并被用于组织学的研究。20世纪40年代,随着电子显微镜的问世,人类对生命现象结构基础的认识深入到更微细的世界。

    从20世纪以来，组织学与多学科相互渗透,新的技术方法不断出现,如组织和细胞培养、细胞融合、放射自显影术、荧光和激光技术,并结合多种实验手段,对组织学进行大量研究,使内容不断充实,研究领域不断扩大,形成了许多新兴交叉学科,如系统生物学、组织工程学、机能组织学等,促进了医学科学进一步的发展。

    我国的组织学教育和科研工作是在20世纪初发展起来的。 在此过程中,老一辈的组织学家如马文昭(1886-1965)、鲍鉴清(1893-1982),王有琪(1899-1995)、张作干(1907-1969)、李肇特(1913-2006)、薛社普(1917-2016)和成令忠(1931-2003)等,在学科建设、科学研究和人才教育等方面做出了历史性贡献。

   二、组织学的学习方法

    组织学是一门重要的医学基础课,与其他医学基础课和临床各科均有密切的联系,在学习中要掌握正确的学习方法,善于自学钻研、纵横联系,做到融会贯通以奠定扎实宽厚的基础。 在学习时应注意以下几个方面:

    1.平面与立体的关系 切片和照片所显示的是细胞、组织和器官的平面结构,同一结构由于切面不同而呈现一定形态差异；通过细胞、组织、器官的平面结构观察,还应建立对它们立体结构的认识，树立整体结构的概念。

    2.注意形态与功能的统一 每种细胞、组织和器官都有一定的形态结构特点,这些特点往往是它们行使一定功能的结构基础。例如分泌蛋白质的腺细胞富有粗面内质网和发达的高尔基复合体；构成肌组织的肌细胞,形态细长,含有大量纵行肌丝，是细胞收缩的物质基础；上皮组织的细胞排列紧密，具有吸收和保护等功能相关的形态结构特点。因此,结构与功能相结合既能达到深入理解，融会贯通,又可抓住要点,掌握规律。

    3.从静态结构了解动态变化 生活的细胞和组织始终处于动态变化之中，在细胞分化、代谢和功能活动过程中，其微细结构也有相应变化。细胞还不断增殖、运动、死亡和更新，即使是细胞外基质，包括坚硬的牙和骨的细胞外基质，也不断地被吸收和重建。胚胎时期的生长发育变化更为显著。 但在切片中所见结构都是某时刻的静态形象.所以要善于从组织的静态时相理解其动态变化。在动物实验中,可在不同实验时期取材观察,分析其动态过程。

    4.纵横联系深化认识 组织学从基本组织至各器官系统都是阐述有机体整体不可分割的部分,许多内容前后关联，相互印证。 如细胞的结构与功能是组织学的基础，贯穿于全书始末；由细胞和细胞外基质构成的各种组织组成不同的器官，器官的功能不仅建立在相关细胞特性的基础上，也与细胞外基质及血管和神经的分布密切相关。 又如细胞间连接结构不仅存在于上皮组织内，而且也分布在其他组织的细胞之间,并参与组织和器官的重要功能活动。