利用动物细胞培养工程生产的产品，多数是为了用于临床的诊断和治疗，因此产品的质量必须符合卫生部门规定的要求，这就需要进行大量艰苦的所谓下游的工作，即产品的纯化。一般来说，下游的纯化工作是费钱、难度大、又没有受到足够重视的工作，这也是当前许多生物技术产品未能很快转化为产品的重要原因。

一、 动物细胞产品常用的纯化方法

这里指的动物细胞产品，主要是指利用基因工程手段构建的工程细胞生产的蛋白类产品，如干扰素、组织型纤溶酶原激活剂、尿激酶原、红细胞生成素等。由于动物细胞表达的产物与工程菌表达的不同，一般都是以分泌在细胞外、具有活性的形式出现在培养上清中，因此不需要如工程菌那样，先要破碎菌体，收集包涵体，并进行复性等处理。尽管如上所述，产品不同，分离纯化的方法和手段也不同。但不外乎离心、超滤、透析、酸处理、盐析或有机溶剂沉淀、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析，以及高压液相等方法。下面仅就这些方法的基本原理和使用中的共性问题作一简单介绍。

（1）离心   蛋白质是一种高分子化合物，其分子量大者可达数千万道尔登，小的也在一万左右。一般来说，其颗粒大小已达到胶粒的范围（1～100mμ），在溶液中靠布郎运动的自由扩散可达到均匀分布。但它与真溶液不同，在强大的离心力场里，蛋白质颗粒会沉降。分子量越小，使其沉降所需的离心力越大。考虑到大多数生物制品的不稳定性，以及在离心过程中生产的热量，因此在离心时应采用低温离心。

（2）离子交换层析   各种蛋白质由于其氨基酸的组成不同，有的含酸性氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸较多，有的含硷性氨基酸，如赖氨酸、精氨酸、组氨酸较多，因此在某一特定的pH溶液中不同蛋白质所带的电荷的质和量也就各不相同。当这些蛋白质流经阳离子或阴离子交换柱时，带异性电荷的蛋白质就被吸附。而当溶液的pH值向该蛋白的等电点方向改变，以及提高溶液的离子强度时，就可降低或消除这种吸附，使原被吸附的蛋白质随着改变了pH和离子强度的溶液的流出从柱上解离下来。

（3）凝胶过滤   凝胶是化学键交联的高聚物溶涨体，其中存在着许多网格小孔。蛋白质分子根据其分子量大小，决定了它进入小孔的多少和流经路径的长短。分子量越小，进入小孔的越多，流经的路径越长；反之，分子量越大，进入小孔的越少，流经的路径越短。该法就是利用不同的蛋白质它们的分子量大小不同，在凝胶层析床中移动的速率不同，从而达到分离的目的，故又被称为分子筛层析。

（4）亲和层析   是利用蛋白质分子（配体）能与其相应的配基进行特异性的、非共价键的、可逆的结合来达到分离纯化的目的。

（5）盐析和有机溶剂沉淀    蛋白质的水溶液具有亲水胶体的性质，一是因为它的颗粒大小属于胶粒范围；二是因为蛋白质分子中亲水的氨基酸残基多位于颗粒表面，能与水起水合作用。这种表面的水化层以及所带的电荷，使蛋白保持着溶解状态。如果向溶液中加入大量中性盐，就可破坏蛋白分子周围的水化膜，从而降低了蛋白质的溶解度，使其从溶液中沉淀析出，这就叫盐析。

（6）透析   由于蛋白质分子较大，一般不能透过半透膜，因此可以利用它将蛋白质与分子量较小的其他杂质分离开。最常用的是将盐析分离出的蛋白质置于透析袋内，用蒸馏水透析，以除去大量的中性盐分子；以及用吸湿剂如聚乙二醇等置于透析袋外，使纯化的蛋白质达到浓缩的目的。

（7）高压液相层析   它在方法原理上与一般的吸附层析无差别，只是在动力学性质上进行了改进和提高，如采用粒度小（5～10μm）、筛分窄（±1～2μm）的吸附剂，以及应用高压匀浆装柱技术，提高了层析柱内填充床的致密均匀性，从而取得了更好的分离效果。

二、动物细胞产品的质量要求

用动物细胞生产的生物制品已日益增多，每一种产品都有它自身特殊的质量要求，不可能在这里一一介绍。这里介绍的是有关动物细胞产品，主要指工程细胞生产的生物制品的共性问题。

1．对工程细胞的要求

用于生产生物制品的细胞，已从原先规定的必须用原代细胞，放松要求至允许使用传代细胞，但为了保证人体的健康，各国对用基因工程手段构建的工程细胞株的质量仍规定有很严格的要求。

2．对生产工艺（包括细胞培养和纯化工艺）的要求

要求生产厂房条件必须符合国家规定的GMP要求，所用的一切原材料、试剂都必须质量稳定、可靠，尽可能确定固定的厂家来源，尽可能采用经卫生部门批准，允许用于生产或临床使用的材料。

3．对产品的质量要求

基因工程工程产品的质量要求请详见附件“人用重组DNA产品质量控制要点”，这里仅就一些重点问题作简要介绍。

（1）对产品纯度的要求   在对产品的各项质量指标进行监测时，首要的、最先要测定的是产品的纯度，若纯度未达到要求，则其他指标均无必要检测，必须从新进行纯化。

（2）对产品生物活性的要求   这也是对产品要求的一项重要质量指标，因为药物的作用是靠药物的生物学活性起作用的。由于生物学活性测定的方法不同，其测定的结果可有很大差别，因此必须采用国际上通用的测定方法，并用国际或国家标准品进行矫正，以国际单位报告测定结果。

（3）对产品比活性的要求   所谓产品的比活性即每毫克蛋白质中含有多少单位生物学活性（IU/mg）。每一种产品都有它一定的比活，若比活发生变化，常常反映该产品的空间结构发生了变化。

（4）对产品蛋白质性质的鉴定要求   这是对重组蛋白质产品的特殊要求。由于在蛋白质产品中，有否糖基化、其核苷酸序列是否一致，单纯从产品的纯度和生物活性有时是无法区分的，而这种微小的变化却有可能影响到该产品在体内的作用、免疫原性、半衰期等。根据国家药品监督管理局1997年对生物制品的要求，必须对产品的蛋白质性质作若下鉴定：

①分子量

②等电点

③紫外吸收光谱

④氨基酸序列测定

⑤氨基酸组成

⑥肽图

⑦免疫印迹试验（Western blot）

⑧圆二色光谱分析：它是分析蛋白质二级结构的重要手段之一。

（5）对产品中杂质的检测要求   如上所述，对动物细胞生产的生物制品，其纯度要求在98%以上，也就是说，还允许存在少量的杂质，它主要来源于宿主细胞的蛋白质和核酸，以及在培养和纯化过程中加入的物质。这些杂质若残留量过大，会对人体产生危害。因此必须检测，并控制在规定标准以下。

①宿主细胞的残余蛋白

②宿主细胞的残余DNA含量

③小牛血清残余

④其他物质残余

⑤细菌、病毒和支原体等

⑥热源

（6）对产品的稳定性要求   要求将产品在-20℃、4℃、25℃和37℃下保存，定期地检测其生物活性及其他特性的变化，以便决定该产品的保存条件和期限。一般不能短于两年。若产品在液体条件不稳定，则需冻干保存，必要时需加入保护剂。冻干产品中含水量不得超过3%。

（7）对产品临床前的安全性和有效性评价    所有上述的检测和鉴定要求，都还只是证明药物本身的可靠性，以及生产工艺的稳定性。要对该药的安全性和有效性作出评价，还需要用动物进行一系列试验，包括药理学、毒理学（包括急性和亚急性毒性、遗传毒性、生殖毒性等）、药效学、药代动力学等试验。

（8）对产品临床试验的安全性和有效性评价   根据国家药品监督管理局的规定，在获取新药证书前需完成临床I、II和III期临床试验。

① I期临床试验

② II期临床试验

③ III期临床试验

④ IV期临床试验

一、单项选择题

1. 对动物细胞生产的生物制品，宿主细胞的残余蛋白应小于______。
A.1/10000
B.1/1000
C.1/100
D.1/10
【答案】 B

2. 对动物细胞生产的生物制品，宿主细胞的残余DNA含量应小于______。
A.10000pg
B.1000pg
C.100pg
D.10pg
【答案】 C

3. 在生产中采用了抗体亲和层析，则应检测小鼠IgG含量，应小于______。
A.10ng
B.100ng
C.1000ng
D.10000ng
【答案】 A

4. 新药在人体试验的起始期属于______。
A.IV期临床试验
B.III期临床试验
C.II期临床试验
D.I期临床试验
【答案】 D

5. 对该药进行社会性考察与评价，重点要了解长期使用后出现的不良反应以及继续考察新药的疗效属于______。
A.IV期临床试验
B.III期临床试验
C.II期临床试验
D.I期临床试验
【答案】 A

5. 根据国家药品监督管理局的规定，一般要求400例属于______。
A.IV期临床试验
B.III期临床试验
C.II期临床试验
D.I期临床试验
【答案】 B

二、多项选择题

1. 至今已发现的人干扰素有______。
A.IFN-α
B.IFN-β
C.IFN-γ
D.IFN-δ
【答案】 ABC

2. 根据国家药品监督管理局1997年对生物制品的要求，必须对产品的蛋白质性质作若下鉴定项目包括______。
A.分子量
B.等电点
C.紫外吸收光谱
D.氨基酸组成
【答案】 ABCD

3. 在产品的稳定性要求中，要求将产品保存在______。
A.-20℃
B.4℃
C.25℃
D.37℃
【答案】 ABCD