生物技术制药(2025春)

沈阳药科大学 夏焕章 倪现朴

目录

  • 1 绪论
    • 1.1 课程介绍
    • 1.2 生物技术制药
  • 2 基因工程制药
    • 2.1 概述
    • 2.2 目的基因的获得
    • 2.3 基因工程工具酶
    • 2.4 基因工程载体
    • 2.5 目的基因与载体链接
    • 2.6 重组载体的转化
    • 2.7 重组子筛选
    • 2.8 PCR技术
    • 2.9 琼脂糖凝胶电泳
    • 2.10 宿主菌的选择
    • 2.11 大肠杆菌中的基因表达
    • 2.12 基因工程菌的不稳定性以及对策
    • 2.13 重组工程菌的培养
    • 2.14 基因工程药物的分离纯化
    • 2.15 变性蛋白的复性
    • 2.16 基因工程药物的质量控制
    • 2.17 基因工程药物的制造实例
  • 3 动物细胞工程制药
    • 3.1 动物细胞制药概述
    • 3.2 动物细胞的形态和生理特性
    • 3.3 生产用动物细胞的要求和获得
    • 3.4 动物细胞的培养条件
    • 3.5 动物培养基的种类和组成
    • 3.6 动物细胞大量培养的方法和操作方式
    • 3.7 动物细胞制药的应用
    • 3.8 动物细胞的核移植技术
  • 4 抗体制药
    • 4.1 抗体制药概述
    • 4.2 单克隆抗体
    • 4.3 抗原与动物免疫
    • 4.4 细胞融合与杂交瘤细胞的选择
    • 4.5 杂交瘤细胞性状鉴定
    • 4.6 基因工程抗体及其制备
    • 4.7 抗体工程
    • 4.8 抗体应用实例
  • 5 酶工程制药
    • 5.1 酶工程简介
    • 5.2 酶的来源
    • 5.3 固定化酶与固定化细胞的制备
    • 5.4 固定化酶与细胞的性质评价指标
    • 5.5 酶的人工模拟
  • 6 发酵工程技术概论
    • 6.1 高密度发酵
    • 6.2 基因工程在提高发酵产量中的应用
    • 6.3 基因工程在改善发酵组分中的应用
    • 6.4 基因工程在改进发酵生产工艺中的应用
    • 6.5 基因工程在产生杂合抗生素中的应用
动物细胞制药概述


一、动物细胞的形态

    动物细胞的结构较原核细胞复杂得多,而且已不是靠一个细胞包办一切生理活动,各种细胞都有明确的分工。为了适应其功能的需要,细胞的形态也有了相应的变化,我们称这种变化为分化(或称特化)。我们通常将离体培养的细胞分为两类:贴壁依赖型(anchorage-dependent)和贴壁非依赖型(anchorage-independent),前者可简称为贴壁细胞,后者可简称为悬浮细胞。

1.贴壁细胞

这类细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面,细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子(attachment factor) 才能在该表面上生长、增殖。当细胞在该表面生长后,一般形成两种形态,即成纤维样细胞型(fibroblast-like cell type )或上皮样细胞型(epithilium-like cell type )。

2.悬浮细胞

这类细胞的生长不依赖支持物表面,可在培养液中呈悬浮状态生长,如血液内的淋巴细胞和用以生产干扰素的Namalwa细胞等,细胞呈圆形。

3.兼性贴壁细胞

在实践中我们还可以看到有些细胞并不严格地依赖支持物,它们既可以贴附于支持物表面生长,但在一定条件下,它们还可以在培养基中呈悬浮状态良好地生长,我们把这类细胞称之为兼性贴壁细胞。

二、动物细胞的结构和功能

原核细胞的结构比较简单,它只有细胞膜,细胞质和一个相当于细胞核物质的区域叫做核区或拟核(nucleoid)。动物细胞的结构要比原核细胞复杂得多,它具有细胞膜,细胞质和细胞核。细胞质内还有各种有膜围绕的,形状不同的,并有特殊功能的结构,如线粒体 (mitochodrion) ,高尔基体 (Golgi body) 。由于它们在细胞中的功能有些象机体内的各种器官,所以人们又把它们叫做细胞器 (organelle)。

1.细胞膜(质膜)

它是由脂质分子和蛋白质组成。它在保持细胞形态,体液平衡,代谢,免疫反应和神经调节方面都具有极重要的作用。

2.细胞质

它是位于细胞膜内的半透明物质,其中一类是细胞制造或被细胞吞噬进来的,如脂肪滴、卵黄球和色素粒等。另一类是细胞器,包括内质网 (endoplasmic reticulum)、线粒体、高尔基体、中心体 (centrosome) 和溶酶体 (lysosome) 等。

3. 细胞核

细胞核外有核膜包围,核内充满着不着色或略有嗜酸性的核液,及一些能被硷性染料染成深色的网状或小块叫染色质(chromatin)的物质。当细胞分裂时,染色质形成染色体(chromasome),不同的动物其数量和形态各不相同,即有着特定的“核型”(karyotype ),它在细胞鉴定中有着重要作用。也是用于生产的细胞质量控制的指标之一。

三、动物细胞的化学组成和代谢

1.动物细胞的化学组成

各种细胞的化学组成虽有很多差别,但所有的细胞主要都含有两大类物质,即无机成分,如水和无机盐,及有机成分,如蛋白质,碳水化合物,脂类和核酸。一般情况下,水约占细胞鲜重的85%,无机盐离子占1~1.5%,蛋白质占7~10%,脂类占1~2%,其他有机物质占1.5%。

蛋白质是细胞中最重要的化学成分之一,也是细胞生命活动的基础。构成动物细胞蛋白质的氨基酸主要有20种,根据其所带侧链(R)的性质,可分为非极性,不带电荷极性,正电荷极性和负电荷极性四类。它们对所在蛋白质的性质有一定的决定性作用。

核酸是细胞中另一类生物大分子,它在细胞遗传和代谢方面起着重要的作用,也是生命的主要物质基础之一。核酸主要由糖(五碳糖—核糖)、磷酸和含氮有机碱(嘌呤或嘧啶)所组成。核酸分脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类,区别在于所含的五碳糖,前者是D-2脱氧核糖,后者是D-核糖。一般说核酸中的碱基有四种:腺嘌呤,鸟嘌呤,胞嘧啶和胸腺嘧啶(含于DNA)或尿嘧啶(含于RNA)。

    脂类在维持细胞的结构,物质的透膜运输和能量的储存等方面起着重要作用。磷脂是构成细胞膜系统的主要成分,它具有一个亲水头部和一个疏水头部,对于亲水性和疏水性物质的透膜运输有着重要作用。动物细胞膜的主要磷脂成分为脑磷脂和卵磷脂。

    糖类既是细胞的主要能源,同时也参与细胞的结构组成。它以单糖或多糖形式存在。单糖中最重要的是五碳糖和六碳糖。前者是核酸和核苷酸的组成部分,后者主要是葡萄糖,它在细胞能量代谢中占主要地位。

2.动物细胞的代谢

糖,脂肪和蛋白质的代谢,一般都可以分为三个降解阶段。第一阶段,先由大分子降解为小分子。第二阶段,这些小分子进一步代谢产生三个主要的中间产物,即乙酰辅酶A,α—酮戊二酸和草酰乙酸。第三阶段,这三个中间产物进入“三羧酸循环”。细胞通过这样的代谢获得了生命活动所必需的能。在体外培养的细胞,其主要的能源来自葡萄糖和谷氨酰胺。当氧供应不足时,葡萄糖的降解主要通过酵解途径。

四、动物细胞的分裂和周期

1.动物细胞的分裂

     细胞的分裂一般有三种类型,即无丝分裂 (amitosis)、有丝分裂 (mitosis) 和减数分裂 (reduction division)。体外培养的细胞一般都采取有丝分裂的方式,即首先使细胞核内的染色体复制成两份,并有规则地把它们分开,使分裂后所产生的两个细胞内含有与母细胞相同的染色体数。

2.动物细胞的分裂周期                        

一般说来,动物细胞的整个分裂周期包括间期和分裂期(M期)。间期很长,包括DNA合成期(S期),DNA合成前期(G1期)和DNA合成后期(G2期)。故细胞分裂周期 = 间期(G1期+ S期+G2期)+分裂期(M期)。

    细胞每分裂一次,即传了一代。该“代数”(generation number )与细胞培养中的传代数(passage number )是不同的概念。前者表示细胞分裂的次数,后者表示分种传代的次数。

五.动物细胞的生理特点

根据上述的动物细胞的形态结构和代谢功能,可见动物细胞的生理和生长特点与细菌、酵母和植物细胞有很大的不同,归纳起来,大致有如下一些特点。而这些特点决定了动物细胞的培养和用动物细胞大量生产生物制品有它自己的优势和难度。

1. 细胞的分裂周期长

2.细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制(contact inhibition)现象

3.正常二倍体细胞的生长寿命是有限的

4.动物细胞对周围环境十分敏感

5.动物细胞对培养基的要求高

6.动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同

一、单项选择题

1. 离体培养的细胞分为______。
A.贴壁依赖型
B.贴壁非依赖型
C.兼性贴壁细胞
D.非兼性贴壁细胞
【答案】 B

2. 构成动物细胞蛋白质的氨基酸主要有_______。
A.5种
B.20种
C.25种
D.30种
【答案】 C

3. 在pH 7.0时,天冬氨酸可使其所在的蛋白质分子区域显______
A.中性 
B.强碱性
C.酸性 
D.碱性
【答案】 C

4. 在pH 7.0时,赖氨酸可使其所在的蛋白质分子区域显______
A.中性 
B.强酸性
C.酸性 
D.碱性
【答案】 D

5.一般情况下,细胞中水约占细胞鲜重比例为______。
A.1~1.5%
B.7~10%
C.85%
D.1~2% 
【答案】 C

6.一般情况下,细胞中蛋白质约占细胞鲜重比例为______。
A.1~1.5%
B.7~10%
C.85%
D.1~2% 
【答案】 B

7. 脱氧核糖核酸所含的五碳糖为_______。
A.L-2脱氧核糖 
B.L-核糖
C.D-2脱氧核糖
D.D-核糖
【答案】 C

8. 在动物细胞的整个分裂过程中,DNA聚合酶和RNA的合成属于_______。
A.S期 
B.G2期
C.G1期
D.M期
【答案】 C

9. 在动物细胞的整个分裂过程中,DNA聚合酶和RNA的合成属于_______。
A.G1期 
B.G1期
C.M期
D.S期
【答案】 D

二、多项选择题

1. 离体培养的细胞分为______。
A.贴壁依赖型
B.贴壁非依赖型
C.兼性贴壁细胞
D.非兼性贴壁细胞
【答案】 ABC

2. 原核细胞的结构包括______。
A.细胞膜
B.细胞质
C.内质网
D.细胞核
【答案】 ABD

3. 细胞主要都含有两大类物质,其中无机成分包括______。
A.水
B.无机盐
C.脂类
D.核酸 
【答案】 AB

4. 细胞主要都含有两大类物质,其中有机成分包括______。
A.蛋白质 
B.水
C.碳水化合物
D.核酸
【答案】 ACD

5.构成动物细胞蛋白质的氨基酸根据其所带侧链的性质,可分为______。
A.非极性
B.不带电荷极性
C.正电荷极性
D.负电荷极性
【答案】 ABCD

6.核酸主要组成成分为 ______。
A.核糖
B.磷酸
C.含碳有机碱
D.含氮有机碱
【答案】 ABD

7. 一般说核酸中的碱基有______。
A.腺嘌呤
B.鸟嘌呤
C.胞嘧啶 
D.胸腺嘧啶
【答案】 ABCD

8. 一般细胞的分裂类型为______。
A.无丝分裂
B.有丝分裂
C.纵向分裂
D.减数分裂
【答案】 ABD

三、简答题

1. 一般,糖、脂肪和蛋白质的代谢可以分为几个降解阶段?
【答案】
一般,糖、脂肪和蛋白质的代谢可以分为几个降解阶段;
第二阶段,这些小分子进一步代谢产生三个主要的中间产物,即乙酰辅酶A,α—酮戊二酸和草酰乙酸;
第三阶段,这三个中间产物进入“三羧酸循环”。细胞通过这样的代谢获得了生命活动所必需的能。在体外培养的细胞,其主要的能源来自葡萄糖和谷氨酰胺。当氧供应不足时,葡萄糖的降解主要通过酵解途径。



2. 动物细胞的生理特点?
【答案】
1. 细胞的分裂周期长;
2.细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象;
3.正常二倍体细胞的生长寿命是有限的;
4.动物细胞对周围环境十分敏感;
5.动物细胞对培养基的要求高;
6.动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同.