一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素
1. 含目的产物的起始物料的特点
2. 物料中杂质种类和性质
3. 目的产物特性
4. 产品质量要求
二、分离纯化的基本过程
基因工程药物的分离纯化一般不应超过 5 个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品，成品加工。
三、细胞的破碎方法
可按是否外加作用力而分为机械法和非机械法两类
亦可按所用方法的属性分为物理法、化学法和生物法三类。
1．物理破碎法
（1）高压匀浆法 
（2）高速珠磨法
（3）超声破碎法
（4）高压挤压法
2．化学破碎法
（1）渗透冲击
（2）增溶法
（3）脂溶法
3．生物破碎法
四、固液分离
①离心沉淀
②膜过滤
③双水相萃取

五、重组蛋白质的分离纯化
分离纯化主要依赖色谱分离方法
色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、高压液相色谱等。
蛋白质纯化方法的设计通常根据产物分子的物理、化学参数和生物学特性
1．离子交换层析
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法
（1）离子交换层析的基本原理
（2）离子交换层析的基本操作
利用离子交换色谱分离纯化生物大分子可以采用两种方式：
一是将目的产物离子化，然后被交换到介质上，而杂质不被吸附，从柱中流出，称之为“正吸附”，其优点是目的产物纯度高，还可以起到浓缩的作用，适用于处理目的产物浓度低、工作液量大的溶液；
二是将杂质离子化后被交换，目的产物不被交换而直接流出，称之为“负吸附”，适用于处理目的产物浓度高的工作液，通常只可除去 50～70% 的杂质，产物的纯度不高。
① 离子交换剂的选择
② 离子交换剂的预处理、再生和保存
③ 层析柱
④ 平衡缓冲液的选择
⑤ 上样
⑥ 洗脱
⑦ 样品的浓缩、脱盐
2．疏水层析
疏水层析（hydrophobic interaction chromatography，HIC）是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法。
① 疏水层析的基本原理
② 疏水层析介质
③ 影响疏水层析的因素
④ 疏水层析的应用 
3．亲和层析
亲和层析（Affinity Chromatography，AC）是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的， 改变条件可以使这种结合解除。亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法
（1）亲和层析的基本原理 

亲和层析原理示意图
（2）亲和吸附剂
（3）配体
理想的配体应具有以下性质：
① 与待分离物质有适当的亲和力，亲和力过弱或过强都不利于亲和层析分离。
② 与待分离物质之间的亲和力要有较强的特异性，这是保证亲和层析具有高分辨率的重要因素。
③ 能与基质稳定地共价结合，在层析过程中不易脱落，且与基质偶联后，其结构没有明显改变。
④ 较好的稳定性，能耐受操作条件的影响，可多次重复使用。
（4）基质的活化
（5）配体与基质的偶联
（6）亲和层析的基本操作
①上样
② 洗脱
③ 亲和吸附剂的再生和保存
5．凝胶过滤层析
凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）又称为凝胶排阻层析、分子筛层析，是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。

凝胶层析法原理示意图
（1）凝胶过滤层析的基本原理
（2）凝胶层析的基本操作
① 凝胶的选择
② 凝胶的处理和保存
③ 层析柱的选择
④ 洗脱液的选择
⑤ 加样
⑥ 洗脱速度 
六、非蛋白质类杂质的去除
1．DNA的去除
2．热原质的去除
3．病毒的去除 
七、选择分离纯化方法的依据
1. 根据产物表达形式来选择
2. 根据分离单元之间的衔接选择
3. 根据分离纯化工艺的要求来选择
（1）要具有良好的稳定性和重复性。
（2）要尽可能减少组成工艺的步骤。
（3）组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺与设备也能相互适应，从而减少步骤之间对物料的处理和条件调整。
（4）在工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤，或干扰产品质量。
（5）工艺时间要尽可能短，因稳定性差的产物随工艺时间增加，收率，特别是生物活性收率会降低，产品质量会下降。
（6）工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备要求低，能耗低。
（7）具有较高的安全性。

一、选择题

1. 细胞的物理破碎法有________、_______、______。
A.匀浆法
B. 珠磨法
C.超声法
D.渗透冲击法
【答案】 ABC

二、填空题

1. 基因工程药物的分离纯化一般不应超过 5 个步骤，分别是_______、_______、_______、_______、_______
【答案】
细胞破碎
固液分离
浓缩与初步纯化
高度纯化直至得到纯品
成品加工

2.细胞破碎的化学法主要是_______和_______。
【答案】
渗透冲击法
增溶法

3. 重组蛋白的分离纯化主要依赖_______方法。
【答案】
色谱分离

4. 非蛋白质类杂质有_______、_______、_______、_______。
【答案】
DNA
热原质
病毒

喻昕. 生物药物分离技术. 化学工业出版社, 2008

（美）那伊，（美）阿凯尔斯主编，童望宇等译. 蛋白质药物：开发与生产. 化学工业出版社, 2006