一、获得真核细胞目的基因的方法
1、反转录法
2、逆转录-聚合酶链反应法
3、化学合成法
4、筛选基因的新方法：编码序列富集法，岛屿获救PCR法，动物杂交法，功能克隆法，构建cDNA文库，差异显示技术的应用。
二、反转录法的实验流程
1、mRNA的纯化
2、cDNA第一链的合成
3、cDNA第二链的合成
4、cDNA克隆
5、将重组体导入宿主细胞
6、cDNA文库的鉴定
7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
三、对已发现基因的改造

一、选择题

1. 逆转录法中cDNA第二链的合成是在_______的催化下完成的。
A. DNA聚合酶Ⅱ
B. DNA聚合酶Ⅲ
C. DNA聚合酶Ⅰ
D. DNA连接酶
【答案】

2. 真核细胞中mRNA的3'末端常含有_______组成的末端。
A. 多聚鸟苷酸polyG
B. 多聚胞嘧啶polyC
C. 多聚腺苷酸polyA
D. 多聚胸腺嘧啶polyT
【答案】

二、填空题

1. 在_______缓冲液的作用下，mRNA被特异的结合在寡聚_______纤维素柱上，在逐渐_______盐浓度情况下，mRNA被洗脱下来。
【答案】

2. 用于cDNA克隆的载体有_______和_______，根据重组后插入的cDNA是否能够表达，经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为_______和_______。
【答案】

3. 从 cDNA 文库分离特异 cDNA 克隆的方面主要采用_______和_______两种方法。
【答案】

三、简答题

1. 为何不能直接克隆真核基因，必须采用特殊的方法分离目的基因？
【答案】
真核细胞中单拷贝基因只是染色体DNA中的很小一部分，大约为其10-5～l0-7，即使多拷贝基因也只有其10-5，因此从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难；
另外，真核基因内一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，即便分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA的转录后加工系统，真核基因转录的mRNA也不能加工、拼接成为成熟的mRNA。

2. 通过逆转录法获得目的基因的具体过程？
【答案】
1.mRNA的纯化
2.cDNA 第一链的合成
3.cDNA 第二链的合成
4.cDNA 克隆
5.将重组体导入宿主细胞
6.cDNA 文库的鉴定
7.目的 cDNA 克隆的分离和鉴定

3. 化学合成法获得目的基因的限制主要有哪些？
【答案】
一是不能合成太长的基因。目前 DNA 合成仪所合成的寡核苷酸片段最长不超过60bp，因此此方法只适用于克隆小分子肽的基因。
二是人工合成基因时，遗传密码的简并性会为选择密码子带来很大困难，当以氨基酸顺序推测核苷酸序列时，不一定与天然基因完全一致，易造成中性突变。
三是费用较高。

4.噬菌体克隆载体λgt10 和 λgt11用于构建 cDNA 文库的优势有哪些？
【答案】
一方面有较高的克隆效率，只需少量 DNA 便十分有效地产生许多克隆，每 ng cDNA 可产生 5000 个克隆；
另一方面又可容纳较大分子量的外源 DNA 片段。由于噬菌斑的筛选和操作较筛选细菌菌落在技术上更方便，因此这些载体在构建文库时优于质粒载体 pBR322。

5. cDNA 片段与载体的连接通常采用哪两种方法？具体如何操作？
【答案】
一种方法是加同聚尾连接：
用 3' 末端脱氧核苷酸转移酶催化，使载体与 cDNA 的 3' 末端带上互补的同型多聚体序列，借助同型多聚体的退火作用形成重组分子，最后用 T4-DNA 连接酶封口。若载体加上 polyC（或A）的尾巴，则 cDNA 加上 polyG（或T）的尾巴，这两种粘性末端只能使载体与 cDNA 连接而不能自我环化。
另一种方法是加人工接头连接：
用T4-DNA 连接酶在平末端接上人工接头可以使 DNA 发生连接。所谓人工接头是指由人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片段。cDNA 连上人工接头后，用该种限制酶酶切就可得到粘性末端，从而能够与载体连接。

http://en.wikipedia.org/wiki/Synthetic_biology

http://en.wikipedia.org/wiki/Plasmid

http://en.wikipedia.org/wiki/Vector_(molecular_biology)

http://en.wikipedia.org/wiki/Expression_vector

吴乃虎编著. 基因工程原理. 科学出版社. 2005

J. 萨姆布鲁克等著，黄培堂等译．分子克隆实验指南：第三版，科学出版社，2008