一、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法
1．抗生素生物合成基因的结构特点
已经克隆的23种抗生素生物合成基因簇进行结构分析，发现它们具有以下特点:
① 链霉菌抗生素生物合成基因组的一个典型特性是高G-C碱基组成，（G+C）%达70%以上；
② 对已克隆的抗生素生物合成基因的分析发现，它们大多处于一个基因簇中（表7-3）；
③ 抗生素生物合成基因除定位在染色体上外，还发现有的定位在质粒上。
表7-3 抗生素基因簇的组成
抗生素 | 产生菌 | 基因簇 |
放线紫红素 阿维菌素 碳霉素 头孢菌素C 氯霉素 cytorhodin 金霉素 道诺霉素 红霉素 福提霉素 榴菌素 林肯霉素 次甲基霉素 无活菌素 nosiheptide 土霉素 phosphinothricin 嘌呤霉素 螺旋霉素 链霉素 5’-羟基链霉素 tetracenomycin 泰乐霉素 | S. coelicolor A3(2) S. avermitilis S. thermotolerans S. clavuligerus S. venezuelaeS. purpurascensS. aureofaciensS. peuceticus Sacch. Erythrea M. olivastereospora S. violaceoruber S. lincolnensis S. coelicolor S. griseus S. actuosus S. rimosus S. hygroscopicus S. alboniger S. ambofaciens S. griseus S. glaucesens S. glaucascens S. fradiae | B, R, P, T B B, R, P, T B B B B, P, T B, R, P B, R, P, T B, P B B, P, T B, R, T B, P B, R B, P, T B, R, P B, R, P, T B, R, P, T B, R, P, E, T B, R, P, E, T B, R B, R, P, T |
B=biosynthesis, E=extracellular processing, P=protection(resistance)
R=regulation, T=transport(export)
2. 克隆抗生素生物合成基因的策略和方法
近年来，已总结出7个利用质粒和噬菌体载体来克隆抗生素生物合成基因簇的方法：① 在标准宿主系统中克隆检测单基因产物；② 阻断变株法；③ 突变克隆法；④ 直接克隆法；⑤ 克隆抗生素抗性基因法；⑥ 寡核莆酸探针法；⑦ 同源基因杂交法。
表 7-4 克隆的抗生素生物合成基因所用的方法
抗生素 | 克隆所用的方法 |
1. b-内酰胺 棒酸 异青霉素N 头孢菌素C 2. 芳香多聚体 放线紫红素 榴菌素 tetracenomycin C 土霉素 3. 大环内酯 泰乐星 碳霉素 红霉素 milbemycin 杀假丝菌素 阿维菌素 4. 氨基糖苷类 链霉素 fortimicin 西梭霉素 5. 其他类 次甲基霉素 十一烷基灵红菌素 放线菌素 D bialaphos |
与突变株互补 环化酶序列，寡核苷酸探针 整个途径克隆到异源受体
与突变株互补 利用actI基因作探针 与突变株互补 克隆抗性基因
先纯化O-甲基转移酶，再利用寡核苷酸探针 克隆抗性基因 克隆抗性基因 利用actI基因作探针 通过检测在S. lividans中表达的对氨基苯甲酸酶活性 与突变株互补
与突变株互补 与突变株互补 克隆抗性基因
突变克隆法 与突变株互补 通过检测在S. lividans中表达的吩噁嗪酮合成酶活性 克隆抗性基因，与突变株互补 |
二、 几种典型的抗生素生物合成基因簇的结构
1．放线紫红素
图7-4 放线紫红素生物合成基因图谱和生物合成途径
2．红霉素
图7-6 脱氧红霉内酯B生物合成过程
3. 青霉素
图7-7 （a）顶头孢霉中所发现的头孢菌素C生物合成途径
（b）产黄青霉和构巢曲霉中研发现的青霉素G生物合成途径
4．链霉素
图7-8 链霉素生物合成基因簇的结构
三、 提高抗生素的产量
1． 增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数
2. 通过调节基因的作用
3．增加抗性基因
四、 改善抗生素组分
伊维菌素(ivemectins)是通过化学方法由阿维菌素B2a制得的。阿维菌素(avemectins)产生菌能产生8个组分，4个主要组分Ala、A2a、B1a、B2a和4个次要组分Alb、A2b、Blb、B2b（图7-10）。A与B组分的区别在于C-5的羟化基团上是否连有甲基，这是由5-0-甲基转移酶基因（aveD）决定的；a和b组分的区别在于C-25侧链的不同，如果C-25是仲丁基，其支链来源于异亮氨酸，如果C-25是异丙基，其支链来源于缬氨酸；1和2组分区别的是由C-22、C-23的碳链脱氢酶基因（aveC）引起的。由于阿维菌素Bla和B2a是活性最好的主要组分，而且只有B2a组分才是制备伊维菌素Bla的原料。所以选育只产生阿维菌素B2a组分的菌种是非常有意义的。如果从原株出发，获得只产生伊维菌素B2a的菌株，至少要引入3个突变：①aveD基因突变使5-0-甲基转移酶失活，只产生B组分；② 选择性地利用支链氨基酸，使异亮氨酸掺入阿维菌素的糖苷配基，失去缬氨酸掺入能力，只产生a组分；③ aveC基因突变使C-22、C-23脱氢酶失活，只产生2组分。
R1 | R2 | X-Y | ||
avermectin
ivermectin
| A1a A1b A2a A2b B1a B1b B2a B2b B1a B1b | CH3 CH3 CH3 CH3 H H H H H | C2H5 CH3 C2H5 CH3 C2H5 CH3 C2H5 CH3 C2H5 CH3 | CH=CH CH=CH CH2-CH(OH) CH2-CH(OH) CH=CH CH=CH CH2-CH(OH) CH2-CH(OH) CH2- CH2 CH2- CH2 |
图7-10 阿维菌素各组分的结构
五、 改进抗生素生产工艺
Magnolo等人把血红蛋白基因克隆到天蓝色链霉菌（S.coelicolor）中，在氧限量的条件下，血红蛋白基因的表达可使放线紫红素的产量提高10倍之多（图7-11）；Demodena 等人将血红蛋白基因引入产黄顶头孢霉菌（Acremonium chrysogenum）中，限氧时血红蛋白表达量较高，头孢菌素C的产量比对照菌株提高5倍。
六、 产生杂合抗生素
1． 生物合成途径中某个酶基因的突变
（1）6-去氧红霉素A 红霉素产生菌中6-去氧红霉内酯B在C-6羟化酶（EryF）的作用下，转化成红霉内酯B，如果eryF基因失活，则会得到6-去氧红霉内酯衍生物。
（2）△-6,7-脱水红霉素C 编码红霉素内酯环聚酮体合成酶的基因是eryA第四单元中产生的烯酰还原酶催化在内酯环C-7位上形成次甲基，如果烯酰还原酶基因失活，则聚酮体的烯基由于不能还原而成为新的聚酮体。
2．在生物合成途径中引入一个酶基因
Epp等克隆了耐温链霉菌的16元大环内酯碳霉素的部分生物合成基因，将编码异戊酰辅酶A转移酶的carE基因转到产生类似结构的16元大环内酯抗生素螺旋霉素产生菌生二素链霉菌中，其转化子产生了4″-异戊酰螺旋霉素（图7-12）。
图7-12 丙酰螺旋霉素和异戊酰螺旋霉素的结构
七、 组合生物合成
1． 组合生物合成
组合生物合成的特点是：① 通过多个催化功能的组合完成复杂化合物的合成。② 合成的化合物为天然产物及其衍生物。③ 适用于化学合成困难的复杂化合物。
2． 组合生物合成的设计
聚酮体是一大类结构多样化的具有重要医用价值的天然产物，包括大环内酯类、四环类、蒽环类、聚醚类等。选择聚酮体进行组合生物合成的优点是：① 聚酮体生物合成基因的序列保守，合成的生化规律比较容易摸清和掌握并实际应用。② 聚酮体生物合成基因都串联成簇，便于克隆表达。③ 容易用发酵的方式生产。④ 化合物的多样性和新颖性。
组成聚酮体生物合成途径的酶称为聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS），它分为两类：I类PKS也称为模块（modular）类，如红霉素（erythromycin）、雷帕霉素（rapamycin）、利福霉素（rifamycin）、阿维菌素（avermectin）等；II类PKS也称为叠代或芳香类，因为它主要合成芳香族的化合物，如蒽环（anthracycline）类及四环（tetracycline）类化合物。这些化合物在抗感染、抗肿瘤及免疫抑制等方面的巨大应用价值。
一、选择题
1. 链霉素抗生素合成基因组的典型特征是_______。
A. 高G-C碱基组成，含量高达90%；三联体密码子的第三个碱基的G,C比例极高
B. 高A-T碱基组成，含量高达70%；三联体密码子的第三个碱基的G,C比例极高
C. 高G-C碱基组成，含量高达70%；三联体密码子的第三个碱基的A,T比例极高
D. 高G-C碱基组成，含量高达70%；三联体密码子的第三个碱基的G,C比例极高
【答案】 D
二、简答题
1. 简述抗生素生物合成基因的特点？
【答案】
抗生素合成基因的特点是：
（1）抗生素合成基因的一个典型特点是高G-C碱基组成，含量达70%；三联体密码子中的第三个碱基的G-C比例极高；
（2）对已克隆的抗生素合成基因进行分析，发现他们大多处在一个
（3）抗生素合成基因除定位在染色体上外，还发现定位在质粒上。
2. 利用基因工程如何提高抗生素的产量？
【答案】
利用基因工程可通过以下方法提高抗生素的产量：
（1）增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数；
（2）通过调节基因的作用；
（3）增加抗性基因。
3. 基因工程在抗生素生产中有那些应用？
【答案】
通过基因工程明确抗生素合成基因的典型特点和克隆的方法，解析合成基因的结构，深入了解微生物的生长代谢过程，更有效的控制抗生素的生产，为人类的健康提供更多更有效的产品，主要体现在以下几方面：：
（1）提高抗生素的产量；
（2）改善抗生素的组分；
（3）改进抗生素的生产工艺；
（4）产生杂合抗生素，提供新的药物来源；
（5）用组合生物合成方法合成复杂化合物。
王以光，抗生素生物技术. 化学工业出版社, 2009
http://baike.baidu.com/view/35998.htm
http://en.wikipedia.org/wiki/Metabolic_engineering
