认识显微镜

实验图1-1  显微镜的结构

实验一  普通显微镜的使用及细胞的基本形态观察

[目的要求]

1.掌握普通光学显微镜使用方法，临时装片标本的制作方法。

2.熟悉光学显微镜下不同细胞的基本形态和结构。

3.了解普通光学显微镜构造和各部分的性能，动物细胞与植物细胞结构的异同点；不同染液对细胞观察的影响。

[材料与用品]

1.材料：洋葱头、牛蛙、人口腔上皮细胞。

2.用品：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、娃板、消毒牙签、小刀、吸水纸、拭镜纸。0.1mol/L稀碘液、蒸馏水、吉姆萨染色液、甲基绿-派洛宁染色液、0.9%生理盐水等。

[方法与步骤]

一、显微镜的构造与使用

（一）显微镜的构造和性能

    光学显微镜是研究生物学的常用工具，由一组光学放大系统和支持及调节它的机械系统组成，有的还带有光源部分。其结构见实验图1-1。

1．机械系统

（1）镜座和镜柱  

镜座是显微镜底部的承重部分，它使显微镜重心较低不致倾倒。其上直立的短柱部分为镜柱，支持镜臂和镜台。

（2）镜台  

又名载物台，是放置玻片标本的平板。其中央有一圆孔，称镜台孔（也称通光孔），以便从下方来的光线由此通过。镜台上装有标本移动器（或称推进尺），既可固定载玻片又可转动螺旋前后左右移动标本。有的标本移动器上还带有标尺，可利用标尺上的刻度寻找所要观察的标本位置。

（3）镜臂  

为镜柱之上弯曲的部分，以便于持握。

（4）镜筒  

为镜臂上端的圆筒部分。其顶端安置目镜，下端连接物镜头和转换器。由物镜到目镜的光线便由此通过。

（5）物镜转换器  

是镜筒下端一个可旋转的圆盘。其上可装置数个接物镜，以便观察时换用不同倍数的物镜。

（6）调焦螺旋

调焦螺旋是显微镜上的一个重要装置，因为对不准焦距就看不清被观察的物体。有粗调节器和细调节器，能使镜筒或镜台升降，调节物镜和观察材料间的距离，以求得清晰的图像。粗调节器升降镜筒的距离较大，约为50毫米，主要用于寻找目的物。由低倍镜观察标本时，用粗调节器调焦距。细调节器升降的幅度较小，约为1.8～2.2毫米，能精确地对准焦点，取得更清晰的物象。使用时，一般拧动不超过一圈。由低倍镜转高倍镜观察时，则用细调节器调焦。

2．光学系统

光学系统包括照明系统和成像系统。前者由照明光源、聚光器和虹采光圈组成。后者由接物镜和接目镜组成。

（1）照明光源

位于显微镜的下方，镜座之上，光线通过聚光器透过通光孔，镜座的右侧有可调电源开关，可调节光线的强弱。

（2）聚光器 

在载物台的下面，由二、三块凹透镜组成。作用是聚集来自光源的光线，使光线增强，射入镜筒中，并使整个物镜所包括的视野均匀受光，提高物镜的鉴别能力。聚光器可以升降，其上还附有光圈，以调节进入物镜的光线。所以在使用高倍镜时，必须配以聚光器。

（3）虹采光圈（可变光阑）

位于聚光器下面，由许多金属片组成。推动操纵光圈的调节杆，就可调节光圈的大小，使上行的光线的强弱适宜，便于观察。

（4）接物镜（物镜）

由数组透镜组成，可放大物体。透镜的直径越小，放大倍数越高。每架显微镜均备有几个倍数不同的物镜，其上放大40倍（40×）以下的叫低倍镜，一般为10倍（10×），4倍（4×）；放大40倍（40×）以上的叫高倍镜；放大100（100×）倍以上的叫油镜。物镜是显微镜取得物象的主要部件，其作用为利用入射光对被观察的物体做第一放大的造像。

（5）接目镜（目镜）

是金属的圆筒，上端装有一块较小的透镜，下端装有一块较大的透镜，其作用是将物镜所放大和鉴别了的物象进行再放大。目镜内可附加指针和测微尺。每架显微镜常备有几个倍数不同的目镜，其上也刻有5×、10×、12.5×等放大倍数，显微镜的放大倍数即是所用的目镜放大倍数跟所用物镜放大倍数的乘积。

（二）显微镜的使用方法

（1）安放显微镜

打开镜箱，右手紧握镜臂，左手平托镜座，轻放桌上使镜臂正对自己的左胸，距离桌子边缘几厘米处。

（2）检查

检查各部分部件是否完好，镜身、镜头必须清洁。

（3）对光

打开光源开关，在镜检全过程中，根据需要转动开关旋钮，调节所需光线的强弱，还可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器调节。

（4）调焦

光线对好后，就可将标本片放在载物台上固定好，有盖玻片的一面朝上，被检物体对准圆孔正中，用标本移动器卡紧，开始调焦。先用低倍镜观察，因为低倍镜视野范围较大，易于全面地观察材料和寻找材料中需要重点观察的部分。转动粗调节器，使载物台缓缓上升，这时必须由侧面仔细观察，使标本和物镜的距离靠近。然后眼睛通过目镜仔细观察视野，转动粗准焦螺旋，使载物台缓慢下降，直至看清标本物像。然后，再轻轻转动细调节器，以便得到更清晰的物像。

（5）低倍镜观察

低倍镜下调焦距找物像时，若被检物体不在中央，可用标本移动器略微移动玻片，使物像恰好位于视野中央。若光线不适，可拨动虹彩光圈的操纵杆，调节光线，使物像最清晰为止。

（6）高倍镜观察

低倍镜下看清后，转动转换器，将高倍接物镜头转至镜筒正下方（转换时切勿动调焦螺旋）。这时，轻轻转动细调节器，就可看清楚目的物。注意：此时不可用粗调节器，否则会压碎玻片损伤镜头。由于显微镜所观察的生物材料是立体的，故在观察时必须随时转动细调节器，才能了解不同光学平面的情况。

在高倍镜下，将制片中的被检物按从上到下，从左到右的顺序移动，观察一遍。再换成低倍镜，然后又转高倍镜反复观察几次，以熟练高倍镜的使用。

用高倍镜观察完后，若有必要，可再换用油镜头观察。

（7）油镜观察

高倍镜下看清物象后，将高倍镜头转离通光孔。在玻片标本透光处滴加一滴香柏油。然后将油镜镜头对准通光孔，从目镜中观察，首先调节光圈与聚光器，使光亮适当加大，再用细调节器调至物像清晰。如果镜头已提升出香柏油面而未见物像时，应按上述过程重复操作。使用完毕，取下载玻片，用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再取擦镜纸沾取少量二甲苯擦镜头，然后用干净擦镜纸擦去镜头上残留的二甲苯。二甲苯用量不宜过多，擦拭时间应短。

（8）复原

显微镜使用完毕，先使载物台下降，取下玻片，擦净载物台和物镜，将各部分还原，并转动镜头转换器，将物镜从镜台孔挪开，成八字形分列，关掉光源，罩上镜套。

二、细胞的形态观察

（一）植物细胞的结构

1.洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片标本的制作与观察

1.1制片方法

（1）取一洗净的载玻片，用纱布擦干，于玻片中央滴1滴蒸馏水。用尖头镊子从洋葱肉质鳞片内表撕下一小块表皮，铺在水滴上，用解剖针轻轻将其压入水中，使表皮展平。

（2）镊子夹住洗净擦干的盖玻片的一边，使另一边接触水滴的边缘，然后慢慢地放下，以便驱走盖玻片下的空气，不致产生气泡。

（3）用吸水纸吸去盖玻片周围的水，置显微镜下观察。

1.2观察

（1）在低倍镜下，可见洋葱表皮细胞略成长方形，排列紧密，每个细胞内有一圆形或扁圆形的细胞核。

（2）为了更清楚地显示洋葱表皮细胞的结构，可用稀碘液染色。染色时，将玻片从镜台上取下，于盖玻片的一侧加1滴碘液，用吸水纸从盖玻片另一侧吸引，使碘液通过洋葱表皮以染色，再置显微镜下观察。

（3）先用低倍镜找一个清楚的细胞移至视野中央，再换高倍镜观察。可见细胞最外面被棕黄色细胞壁所包围，细胞壁以内是着色较浅、近于透明的细胞质。细胞质内有一个或几个或大或小的透明的液泡，在细胞中央或靠近细胞壁，有一细胞核，核内有染色成棕黄色的核仁(见实验图1-2)。细胞质外围有一薄层细胞质膜，在生活细胞中不易分清。

 图1-2  洋葱鳞片叶表皮细胞

拓展：(1)洋葱表皮细胞DNA、RNA的显示

①撕取洋葱表皮一小片，置于载玻片上。

②滴一滴甲基绿-派洛宁染液，染色30～40分钟。

③用吸管吸一滴蒸馏水冲洗，立即用吸水纸吸干(因派洛宁易脱色)。

④盖上盖玻片，镜检可见细胞质和核仁呈淡红色或红色，表示RNA，而核质呈蓝色表示含有DNA。

（二）动物细胞的结构

1.人口腔上皮细胞临时装片标本的制作与观察

1.1制片方法

（1）滴一滴0.9%生理盐水于载玻片中央，将消毒牙签粗的一端伸入口腔内，在口腔颊内轻轻刮几下，将刮下的白色粘性物质放入载玻片上的液滴内，分散均匀，盖上玻片，吸去多余的液体。

（2）将此装片置低倍镜下寻找较分散的单个细胞观察，可见人口腔上皮细胞呈扁圆形和扁平多边形（见图1-23）。

1.2观察

若观察不够清楚，可用醋酸洋红染色（方法同碘液染色）后，再置低倍镜下并转高倍镜观察。可见细胞外围仅有一大致可辩的细胞界限，细胞核呈鲜红色位于细胞中央或近中央，细胞质呈浅红色。

图1-3 人口腔粘膜上皮细胞

2.蛙血涂片的制备与观察：

取一只蟾蜍，将其处死。处死的方法有∶

（1）脊髓搅碎处死法∶取一只蟾蜍，左手握住其股部，腹部贴着掌心，食指压住蟾蜍头部前端使其尽量屈腹。在头和躯干之间可摸到一凹陷处（即枕骨大孔），用解剖针向内刺入约1～2mm深（注意不要太深），随即将针尖向前搅碎脑组织，然后再转向后深入椎管内，搅碎脊髓，待看到蟾蜍后肢强直肌肉松弛时为止。

（2）麻醉处死法∶即先把活的蟾蜍放入标本瓶内，用解剖镊夹住棉球，蘸上乙醚或氯仿投入标本瓶内，立即盖好，经5分钟，可见蟾蜍肌肉松弛，全身瘫软，逐渐死去。

2.1制片方法

2.2观察

取制作好的蛙血涂片，晾干，浸入95％乙醇中固定5分钟，室温晾干。在标本上滴数滴甲基绿-派洛宁染色液，染色5～l0分钟，用蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去玻片上多余水分(不要吸得过干)。置低倍镜下观察，选择色泽清楚，细胞不重叠部分换高倍镜观察，可见蛙红细胞呈椭圆形，中央有一染成蓝绿色的细胞核，细胞质为淡红色。视野内有时可见到圆形的白细胞，其核的形状不规则。

3.骨骼肌标本的制备与观察

3.1制片方法

剪开蟾蜍腿部皮肤，剪下一小块肌肉束（约7.5px），放于载玻片上，用镊子和解剖针沿着肌肉束的方向剥离肌肉束，获得如头发丝粗细的肌纤维羚置于载玻片上，滴少许生理盐水，盖上盖玻片。

3.2观察

肉眼观察：切片上有两块标本，长条形的为纵切面，椭圆形的为横切面，

骨骼肌组织纵切面：置于低倍镜下观察，骨骼肌纤维呈长圆柱形，相互平行排列聚集呈束。由于肌纤维长，标本中往往不能见到其两端。分辨一条肌纤维的两侧边界，转高倍镜（适当放低聚光器，将视野调暗）。每条肌纤维的两边染色较深为肌膜（实际上并非单一的肌膜，还包括外面紧密贴附的基膜）。肌膜下有许多椭圆形或长形的核纵行排列，注意与周围结缔组织细胞核相区别。每条肌原纤维虽不甚明显，但肌原纤维沿肌纤维长轴平行排列，相邻肌原纤维的明带、暗带相互重叠，使整条骨骼肌纤维显出着色深浅不同的横纹。暗带为深红色，明带着色浅，其中央有—条细线为Z线。

骨骼肌组织横切面：置于低倍镜下观察，标本为一块肌肉器官的横切面，表面有致密结缔组织包绕为肌外膜（即深筋膜）；它伸入肌肉内，包裹着许多肌纤维为肌束膜；每条肌纤维周围有薄层结缔组织为肌内膜。（不易分辨）。高倍镜观察：肌纤维呈多边形（HE制片所致），肌膜染色深红，核位于肌膜下，呈圆形或卵圆形，肌纤维内有许多红色点状的肌原纤维，肌原纤维之间着色甚浅为肌浆。

4.蟾蜍精子标本的制备与观察

4.1制片方法

从雄性蟾蜍的腹腔内取出睾丸，洗净，放入盛有生理盐水的培养皿中，用剪刀剪碎，使精子游离出来而成精子悬液。取一滴精子悬液放在载玻片中央，盖上盖玻片，即可观察。

4.2观察

在低倍镜下可见到如逗号样的结构，这便是精子（注意调节光线）。换高倍镜观察，可见精子前端膨大如锥形（侧面观）或椭圆形（正面观）的头部，细胞核位于其中（不易观察，也可用吉姆萨染液染色帮助识别）。其后有一细丝状的尾部，与其运动有关。

5.脊髓压片标本的制备及观察

5.1制片方法

取已处死的蟾蜍，在口角处剪去头部，除去延脑，剪开椎管，可见乳白色脊髓。取一段脊髓（约7.5px）放在平皿内，用生理盐水洗去血污，放在载玻片上。取另一载玻片盖上，用拇指挤压，使脊髓薄薄的铺于载玻片上。将上面的载玻片移去，即可得到两张压片。在压片上滴一滴甲苯胺蓝（吉姆萨染液/甲基绿派洛宁染液？）染液，染色10分钟，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染液。

5.2观察

在高倍镜下观察，染色较深的小细胞为神经胶质细胞，无突起；染成蓝紫色的，有长短不等突起的细胞为神经细胞，神经细胞中膨大的部分为胞体，其内有深蓝色圆形细胞核。

[作业与思考]

1.完成实验报告； 

          2. 绘制观察到的细胞结构典型图，进行识别标注，在线作业中上传至课程平台；

     3.思考高等植物细胞和动物细胞结构异同点。

 

附录：

生物绘图的要求及方法：

1. 绘图基本工具：铅笔(HB、3H)、尺、橡皮、绘图纸等。

     2. 生物绘图必须真实，绘图前应选择优良的、有代表性的标本，按照实物的形状、各部分比例、位置及毗邻关系进行描绘。

     3. 绘图需按一定比例，布局整齐美观，大小适中。图的下方注明该图名称。

     4. 图的注释应从各部分结构作出水平引线，结构名称写于引线末端，书写要整齐。

     5. 绘图时先用软铅笔轻轻绘出轮廓，修改后再用硬笔以粗细均匀的线条绘出全图。图的明暗和立体感可用细圆点的疏密来表示，必要时可用彩色描出标本的颜色。