实验的基本原理 

鸡蛋清内含有丰富的溶菌酶（lysozyme），向蛋清中加入一定量的中性盐，并调节pH至溶菌酶的等电区，溶菌酶即可结晶析出。如结晶不纯，可重结晶。 溶菌酶之所以溶菌，是因为它能催化革兰氏阳性细 菌细胞壁黏多糖水解。测定溶菌酶活力，可用某些细菌细胞壁作底物，以单位时间内被它水解的细胞壁的量表示酶活力的大小。

主要试剂 

1. 氯化钠（C.P）：应研细      2.五氧化二磷        3.  1mol/L NaOH溶液     

4.丙酮（无水，C.P）     5.   0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.2）     6.溶菌酶晶种 

7.底物悬液：溶菌小球菌（Micrococcus lysodeik Licus）的细胞壁

实验步骤 

1．底物悬液的制作 

溶酶小球菌底物 Lysomicrococcus Substration 

【类别】标准试剂 【批号】140610-201313 

【用途】供溶菌酶效价测定用底物。 

【包装】棕色西林瓶 

【规格】13mg/支 

【贮藏】-20℃ 

【使用方法】取溶酶小球菌底物 1 瓶，加磷酸盐缓冲液 1-2ml,转移到乳钵中研磨，再加磷酸盐缓冲液适量混匀，于 25±0.1℃条件下 450nm 处调整吸收度为 0.70±0.05 范围测定(临用前配制)。 

【注意事项】打开后一次使用。 

【有效期】国家药品标准物质不设具体有效期，按照规定条件保存的 标准物质，在中国食品药品检定研究院发布停用通知前有效。

2.溶菌酶的提纯结晶 

（1）将2只鸡蛋的蛋清置于小烧杯中（蛋清pH不 得低于8.0），慢慢搅拌数分钟，使蛋清稠度均匀， 然后用两层纱布滤去卵带或碎蛋壳，量记蛋清体积。

（2）按100ml蛋清加5g氯化钠的比例，向蛋清内慢慢加入氯化钠细粉， 边加边搅，使氯化钠及时溶解，避免氯化钠沉于容器底部，否则将因局部盐浓度过高而产生大量白色沉淀。 

（3）加完氯化钠，用1mol/L NaOH调节pH至9.5-10.0，随加随搅匀， 避免局部过碱。加入少量溶菌酶结晶作为晶种，4℃放置数天。当 肉眼观察有结晶形成后，吸取晶液一滴，置载玻片上，用显微镜 观察（100×），记录晶形。 （做实验七的时候同时做，实验七用蛋黄，剩下的蛋清做实验八）

（4）4000rpm，离心3min，结晶用0℃丙酮洗涤2次，置真空干燥器干燥。

3、活力测定 （最后一次课做这一部分）

（1）酶液的制备：准确称取干酶粉5mg，用0.1mol/L pH6.2磷酸缓冲液溶解成1mg/ml酶液。用时稀释10倍，则每毫升酶液酶量为100ug。 

（2）将酶液和底物悬液分别置25℃水浴中保温10-15min，然后吸底物悬液3.0ml置比色杯中，比色测定A450nm，此为零时读数。然后加入酶 液0.2ml（20ug酶），迅速摇匀，从加入酶计时，每隔30s测一次 A450nm，共测3次。

（3）本实验的酶活力单位定义为：每分钟A450nm下降0.002为一个活力单 位（25℃，pH6.2） 

 P=(A0-A1)/m ×500 

式中 P：每毫克酶的活力单位（U/mg）； A0：零时450nm处的吸光度； A1：1min时450nm处的吸光度； m：样品的质量（mg）； 500：0.002的倒数，即相当于除以0.002。

注意事项 

1.鸡蛋清的搅拌速度切忌不能起泡，搅拌方向不得改变，搅棒应光滑， 这些都是防止蛋白变性的措施。

2.氯化钠细粉应慢慢加入，并边加边搅，防止因局部盐浓度过高而产 生大量白色沉淀。 

3.调pH时，氢氧化钠应随加随搅匀，避免局部过碱。 

4.底物悬液中加入酶液后应迅速摇匀并从加入酶液开始计时