实验八  从鸡蛋清中提取溶菌酶

鸡蛋是最重要的农副产品之一，产量很高，但因附加值低，相对利润较少；利用鸡蛋深加工技术分离制备生化产品，可通过增加技术含量，提高利润。鸡蛋深加工技术可使鸡蛋的非水部分几乎全部被利用，并且具周期短、技术难易程度适中的优点。可制备的生化产品主要有溶菌酶、卵磷脂、胆固醇、卵黄油。碳酸钙、丙酸钙、鸡卵类粘蛋白、卵壳膜等，均有较好的市场。溶菌酶和卵磷脂广泛存在于动、植物细胞中，但鸟类和家禽的卵中含量最高，以鸡蛋为原料开发生产溶菌酶和卵磷脂是最经济的途径。

溶菌酶是一种碱性球蛋白，为白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。对PH变化较稳定，酸性条件下对热稳定，碱性介质中易失活。存储条件为2-8℃。

【实验目的】

1、熟练掌握离子层析分离纯化溶菌酶的原理以及离子交换层析的操作方法。

2、理解SDS-聚丙烯酰胺凝胶测定蛋白质纯度与分子量的原理。

【实验原理】

溶菌酶是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖与N-乙酰胞壁酸间的β-1，4糖苷键，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多的碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50℃，最适pH值为6-7左右。

溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高的天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先采用等电点粗法分离，再用DE-52纤维素离子交换色谱和葡聚糖G50凝胶层析分离纯化。

【材料与仪器】

鸡蛋3个，DE-52纤维素，葡聚糖G50，0.5*7cm色谱柱，2.5*20cm色谱柱，烧杯（100ml,250ml,1000ml）,锥形瓶（100ml），玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸，纱布、量筒、10ml离心管、1.5mlEP管、高速离心机、冰箱、电炉。

【试剂配制】

冰醋酸、5mol/LNaOH、20%磺基水杨酸溶液、考马斯亮蓝染色液、脱色液：450mL甲醇：水（1：1）、0.02mol/LPBS（pH8.0）

【实验步骤】

1）鸡蛋清样品制备及粗分离。

将 4～5 个新鲜鸡 蛋的一端敲一个小洞，分离得鸡蛋清（鸡蛋清 pH 值 不得小于 8.0），量其体积，加入两倍蛋清体积的去离子水，边加边缓慢搅拌，拌匀后用两层纱布过滤 除去脐带块和碎蛋壳等， 然后用 1 mol／L 的 HCl 溶 液调 pH 值至 7.0 左右，再用脱脂棉过滤收集滤液。

 2）724 弱酸性阳离子交换树脂的再生及层析。

①724 树脂再生处理：

干树脂清水浸泡，使其充分膨胀并除去细小颗粒和较大杂质；1 mol／L 的 HCl 溶液浸泡 4～6 h， 用去离子水洗至pH 值接近 5．5；1 mol／L 的 NaOH 浸泡 6 h， 去离子水洗至近中 性；再用 1 mol／L 的 NaCl 溶液处理 6 h，使之转型为 Na＋型，pH 值不小于 6．5。 吸干溶液，加 0．15 mol／L、 pH 值为 6．5 的磷酸缓冲液平衡，待用；

①   吸附：

吸干缓冲液后，将处理好的蛋清约200 mL，加入约 32 g 再生的 724 树脂中， 缓慢搅拌吸附 6 h，4℃静置过 夜；

②  洗涤、洗脱：

待分层后，将蛋清液倒去，用去离子水反复冲洗，以去除杂蛋白，滤干树脂，用等体积的0．15mol／L pH 值为 6．5 的磷酸缓冲液洗涤，加入等量的10％（NH4）2SO4 溶液搅拌洗脱 30 min， 使溶菌酶从树脂上洗脱下来， 收集洗脱液，4℃冰箱静置 过夜。 次日，有白色沉淀析出，离心（15 min，10 000 r／min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品；

③  聚乙二醇浓缩：

盐析物用 1 倍去离子水溶解成稀糊状，装入透析袋， 在装有聚乙二醇的试管中吸水浓缩，收 集浓缩液；

④  透析除盐、去碱性蛋白：

4℃条件下，用去离子水透析 24 h 左右， 离心去除透析袋中沉淀， 向透析清液中慢慢加入1 mol／L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使 pH 值上升至 8．0～9．0，如有白色沉淀，即离心去除；

⑤  冷冻干燥：

用 3 mol／L 盐酸调 pH 值至 5．0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。