实验二  等电点沉析法分离牛乳中的酪蛋白

【目的要求】

1、学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。

2、掌握等电点沉析分离的基本操作技术。

【实验原理】

蛋白质、酶、氨基酸、核酸等都是两性电解质，当其溶液在某一pH值时，这些生物大分子的所带的正负电荷数目相等而呈电中性，此时溶液的pH值称为该物质的等电点。生物大分子在其等电点的溶液中，溶解度最低，易发生沉淀，一般疏水性较强的蛋白质可用此法分离。

【实验用品】

1、材料   鲜牛奶

2、试剂

醋酸钠、优级纯醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸馏水、0.2mol/L pH 4.7醋酸-醋酸钠缓冲液其配制如下：

①配A液：0.2mol/L醋酸钠溶液，称NaAc·H2O5.44g溶至200mL。

②配B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优级纯醋酸2.4g溶至200mL。

③取A液约17.7mL，B液约12.3mL混合，用酸度计调得pH 4.7醋酸-醋酸钠缓冲液30mL。

 3、器具

烧杯（100 mL、）、玻璃棒、滴管、量筒、离心机、水浴锅、布氏漏斗、精密pH试纸或酸度计、表面皿、电子天平、抽滤瓶

【实验过程】

方案一：

①  鲜牛奶30 mL及醋酸-醋酸钠缓冲液30mL分别水浴加热40℃左右。并用8层纱布过滤牛奶。

②  量取加热后的牛奶20mL。在搅拌下慢慢加入加热后的醋酸-醋酸钠缓冲液20mL。用酸度计调pH至4.7。

③  将上述混合液冷至室温，离心（3500r/min）15min，弃去上清液，得酪蛋白粗制品。

④  用水洗沉淀3次，离心（3500r/min）10min，弃去上清液。

⑤  在沉淀中加入20mL乙醇，搅拌片刻。将全部的悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。（水-乙醇-乙醇乙醚混合液-乙醚）极性递减

⑥  将沉淀摊开在表面皿上，风干得酪蛋白纯品。

准确称量，计算含量和收率。

方案二：

1、取预先放冰箱中冷却的消毒牛奶6mL，3 000r/min离心10min，除去脂肪层的乳液置50毫升烧杯内，加热至40℃左右，在搅拌下慢慢加入10mL左右预热的醋酸-醋酸钠缓冲液，此时混浊液中有大量絮状物沉下。冷至室温，3 000r/min离心10min，弃去上清液，得酪蛋白粗品。

2、用 蒸馏 水洗沉淀三次（每次5mL左右），3 000r/min离心10min，弃去上清液。

3、将沉淀置研钵中，研碎后，渐加5mL 95%乙醇，静置片刻，将全部悬浮液转移至布氏漏斗抽滤，抽干后的制品，用乙醇-乙醚混合液洗沉淀二次（每次5mL），最后用无水乙醚洗沉淀二次（每次5mL），抽干。

4、将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白制品（称重，记录）。

5、酪蛋白溶液的配制：称取酪蛋白0.1g，置10毫升烧杯中，加5mL 0.2mol/L氢氧化钠溶液，搅匀， 隔水加热，溶解后转移至10毫升容量瓶中，用少量 蒸馏 水洗 烧杯 数次，洗液并入 容量瓶 中，最后加水至刻度处，摇匀，置冰箱中保存备用。

含量=酪蛋白3.5g/100mL牛乳

收率=测得含量/理论 含量% 

①  式中理论含量为3.5 g/100mL牛乳

   【注意事项】

   1、醋酸-醋酸钠缓冲液的配制应规范，pH值应用酸度计测试，以准确达到酪蛋白的等电点。

   2、加入醋酸-醋酸钠缓冲液时，动作要缓慢，并慢慢加入，不可操之过急而大量一次加入。

   3、离心前温度一定要降至室温。

    4.离心前，样品一定要配平。普通离心机两边质量相差3-5克以内，高速离心机相差1克以内。一定要上天平称量，不可以只是肉眼观察体积。

   【结论】

   【思考题】

1、为何用醋酸-醋酸钠缓冲液来调酪蛋白的等电点，可否改用酸或碱来？

2、如何提高酪蛋白的收率？