第六节 分子间的相互作用概述（了解即可）
蛋白质和蛋白质相互作用
● 酵母双杂交技术
● 串联亲和纯化
● 免疫共沉淀
● 表面等离子共振
DNA和蛋白质相互作用
● DNA迁移率变动分析
● 酵母单杂交技术
● 染色质免疫共沉淀
l DNA迁移率变动分析
l DNA迁移率变动分析（DNA mobility shift assay）又称凝胶阻滞分析（gel retardation assay），是一种体外研究DNA和蛋白质相互作用的凝胶电泳技术。
l 非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳中， DNA和蛋白质相互作用的复合物的迁移速率慢于单一的DNA片段，将细胞粗提液或纯化的DNA特异结合蛋白和标记的DNA或RNA探针温育，DNA-蛋白质复合物在电泳中的迁移率取决于蛋白质的分子大小、形状和电荷等因素，而迁移率降低，出现“阻滞”现象。根据所显示滞后带的程度，进行定性或定量分析。
l 酵母单杂交技术
l 是由酵母双杂交技术发展来的，专门用于酵母细胞内研究真核细胞DNA和蛋白质之间相互作用的方法。通过酵母细胞内报告基因表达与非，以及DNA文库筛选，获得与DNA靶序列特异结合的蛋白质基因序列。
l 染色质免疫沉淀分析
l 利用免疫沉淀的原理共沉淀蛋白质与染色质结合的复合物，研究蛋白质与DNA的相互作用。
l 主要步骤包括：①在活细胞状态下，甲醛可以作为一种交联剂使DNA、RNA、蛋白质相互之间交联，形成为复合物。②用超声波将交联后细胞内的复合物切割为较小的DNA片段，同时目的蛋白充分暴露出来，利于抗体识别。③采用密度梯度离心等步骤进一步纯化交联复合物，用与目标蛋白特异性结合的抗体进行免疫沉淀。④用蛋白酶K逆转交联复合物后，用DNA纯化柱纯化DNA并鉴定分析。
l 天然GAL4分子由881个氨基酸残基组成的多肽链组成，有两个可以分开的、功能上相互独立的结构域。
l 一个是位于N端1～174位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNA-bindingdomain, DB)，能够识别和结合GAL4效应基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating sequence ,UAS)。
l 另一个是位于C端768～881位氨基酸残基区段的转录激活域(Activation domain, AD)。
l 酵母双杂交技术是将可能存在相互作用的两种蛋白质，即已知蛋白诱饵蛋白(bait protein)和待研究蛋白猎物蛋白(prey protein)，通过诱饵蛋白和猎物蛋白间的相互作用，使BD和AD在空间结构上重新连接为一个整体，表现出转录因子的活性，而与报告基因的上游激活序列结合，启动转录，使UAS下游启动子调控的报告基因得以表达。
l 反之，如果诱饵蛋白和猎物蛋白之间不存在相互作用，BD与AD就不能结合形成有活性的转录因子，报告基因则不能被启动表达。
l 通过对报告基因表达进行检测，研究蛋白质之间的相互作用。
l 串联亲和纯化
l 传统的串联亲和纯化标签蛋白由钙调蛋白结合肽(calmodulin-binding peptide, CBP)、烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus, TEV)蛋白酶切位点和蛋白A的IgG结合域三部分组成。
l 利用基因重组技术将目的蛋白与标签蛋白CBP端相连，构建该融合蛋白基因的重组载体，转染入细胞后表达融合蛋白。
l 通过串联两步亲和层析获得相互作用蛋白质的复合物。
l 在非变性温和条件下裂解细胞，保持生理条件下目的蛋白与内源相互作用蛋白质复合物的稳定；
l 第一步亲和层析，用IgG为配基的亲和柱分离纯化蛋白质复合物；
l 洗去杂蛋白后, 用含有TEV蛋白酶的洗脱液将蛋白质复合物切割并洗脱下来，获得含有CBP的目的蛋白复合物；
l 第二步亲和层析，该复合物与偶联钙调素的亲和柱结合,洗脱后得到纯化的复合物；
l 经过免疫杂交、质谱分析等手段鉴定出相互作用蛋白质。
l 免疫共沉淀
l 利用加入与蛋白质间相互作用的诱饵蛋白的抗体产生免疫沉淀反应，进而使与诱饵蛋白稳定结合的猎物蛋白共同沉淀的原理，研究生理条件下细胞内蛋白质相互作用的技术。
l 在非变性温和条件下裂解细胞，保持细胞内已经发生的蛋白质间的相互作用；
l 发生相互作用的蛋白质其中之一为已知的诱饵蛋白，加入该诱饵蛋白的抗体，则与发生相互作用的蛋白质复合物产生免疫共沉淀。
l 为了提高方法的通用性，通常在诱饵蛋白上融合标签蛋白，通过加入与标签蛋白特异性结合的抗体，免疫共沉淀与诱饵蛋白相互作用的蛋白复合物。
l 将抗体直接或间接连接到亲和树脂、琼脂珠、磁珠等固相支持物上，提高结合和沉淀效率。
l 通过对标签蛋白具有特异吸附作用的亲和色谱柱分离纯化蛋白复合物，解析后利用质谱等技术鉴定分离得到的蛋白。
l 该方法常用来分析生理条件下目的蛋白在细胞或组织内是否存在与其相互作用的蛋白质。
l 表面等离子共振
l 利用入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面时，引起金属自由电子的共振而使反射光在一定角度内大大减弱，甚至完全消失的物理现象, 从而获取生物分子间相互作用过程中样品的折射率与共振角的动态变化。
l 共振角随金属表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又与金属表面分子的吸附和相互结合状况直接相关，因此通过测量共振角的变化就可以方便地研究生物分子间的相互作用，进而得到生物分子之间相互作用的特异性信号。
