第五节CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术 

CRISPR/Cas系统的发现

    2005年，发现CRISPR的间隔序列与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测其功能可能与细菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关。

    1987年，K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因中，2002年正式命名为成簇的规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR） 。

l 麻省理工学院32岁的张峰是率先利用CRISPR/Cas的系统，以廉价、简易和准确的方式编辑基因组的科学家之一。在2013年1月，他的研究小组证实了这些系统能够在真核细胞中起作用。表明了它有潜力编辑小鼠、大鼠和甚至灵长类动物的基因组。

l 在2013年张峰在Science和Cell各发表了两篇关于CRISPR/Cas的系统论文。

CRISPR/Cas系统的结构和组成

l CRISPR/Cas系统是由CRISPR基因座与其串联的Cas基因（CRISPR-associated genes, Cas genes）组成。

l 根据CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白的种类和同源性，可将CRISPR/Cas 系统区分成3种类型，即类型I、Ⅱ和III，这3种类型标志基因分别是cas3、cas9 和cas10。

l 在CRISPR/Cas系统中，类型Ⅱ CRISPR/Cas系统组成最为简单，除了含有标志基因cas9外，还含有另外三个基因(casl,cas2,和csn2或者cas4)。

CRISPR/Cas系统

l CRISPR/Cas9系统由三部分组成：反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）、Cas基因（CRISPR-associated genes）和CRISPR基因座。

l 1.反式激活crRNA

l 反式激活crRNA是由反式激活crRNA的DNA序列转录的非编码序列。

l 2.  CRISPR 基因座

l 典型的CRISPR基因座由3 部分组成：即位于5′端的前导序列( leader，L)，高度保守的同向重复序列( directed repeat，R), 以及长度相似的间隔序列( spacer，S)

l 3.  cas基因

l 类型 II-A亚型的CRISPR/Cas 9系统中有4 个cas基因，分别为cas9、cas1、cas2和csn2，它们的表达产物主要发挥核酸酶切割作用。

l Cas9蛋白是CRISPR/Cas 9系统的标志性蛋白，由1409个氨基酸残基组成，包括α-螺旋组成的识别区( REC)、由RuvC结构域与HNH结构域组成的核酸酶区以及位于C端的PAM结合区

l Cas9与靶DNA的识别依赖于tracrRNA:crRNA复合体以及位于靶位点下游的PAM序列。

外来入侵的噬菌体或质粒DNA的一小段DNA序列被整合到宿主菌CRRSPR基因座的5′端的两个同向重复序列之间。

CRISPR基因座首先被转录产生非编码的前体CRISPR RNAs (pre-crRNAs)，反式激活crRNA与pre-crRNA结合形成tracrRNA: pre-crRNA双链复合物。该复合物在Cas9的存在下，双链RNA特异的核糖核酸内切酶RNase III进一步切割，最终产生成熟的crRNAs。

crRNA:tracrRNA:Cas9三元复合物扫描外源入侵DNA，当遇到原间区序列邻近基序，且DNA序列可与crRNA互补配对形成一个R环时，Cas9蛋白将分别利用HNH与RuvC结构域核酸内切酶活性对DNA的互补链与非互补链进行切割，而形成DNA的双链断裂。

CRISPR/Cas9系统在基因组的靶基因位点产生DNA双链断裂后，当修复模板序列不存在时，宿主细胞启动非同源性末端连接修复途径（NHEJ途径)，导致基因功能失活。

CRISPR/Cas9系统在基因组的靶基因位点产生DNA双链断裂后，当修复模板存在时，细胞激活基因同源重组修复途径(HR途径），在目标位点引入外源基因。

dCas9 蛋白作为一个可编辑的DNA 结合蛋白，在向导RNA的引导下，通过与目标基因的功能区域结合，调控该基因的转录过程。