第四节 RNA干扰技术

l RNA干扰（RNA interference，RNAi）：外源和内源的双链RNA（dsRNA）在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的技术。

l 其是机体应对外源基因伤害的有效屏障。也是近几年发现的一种全新基因调控方式。

l 《科学》杂志将RNAi评为2002年十大科技进步之首。(比肩基因工程技术、单克隆抗体技术)

全新基因调控方式

l 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞可利用这些dsRNA阻断有害基因表达。

l RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。另外dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都可能引起不需要的相应基因沉默。正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。

一、RNAi的发现

l 1995年，康乃尔大学的Guo等发现无论是反义RNA还是正义RNA（不能与mRNA碱基配对）都能干扰线虫par21基因的表达。这与传统上对反义RNA技术的解释正好矛盾。

l 1998年2月Fire和Mello通过大量工作证实Guo等遇到的正义RNA抑制基因表达的现象是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。他们把相关研究成果发表在《自然》杂志上。 

l 这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNAi。

2006年诺贝尔生理学或医学奖Andrew.Fire和Craig.Mello

二、RNAi的作用机制

1、Dicer将dsRNA切割形成siRNA

l 胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段干扰RNA（大约21～23 bp），即siRNA。

2、 siRNA与多种蛋白质（酶）组装形成RISC

l siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。

3、两方面降解靶mRNA

l 一方面RISC与靶基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA（切割位点是siRNA3‘端12个碱基的位置），被切割后的断裂mRNA随即降解。

l 另一方面siRNA可作为引物与靶RNA结合并在依赖RNA的RNA聚合酶作用下合成更多新dsRNA，新合成dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

l RNAi是转录后水平的基因沉默机制。

三、 RNAi的作用特点
1、特异性

l 只针对同源mRNA进行降解。

l siRNA的21～23个碱基对中有1～2个碱基错配会大大降低对靶mRNA的降解效果。

2、高效性

l 低浓度的双链RNA（1～100 nmol/L）对基因沉默的效果是一致。

3、对靶mRNA位点的选择性

l 实验表明双链RNA对mRNA的结合部位有碱基偏好性，相对而言，GC含量较低的mRNA被沉默效果较好。 　　

4、ATP依赖性

l 在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。

5、受多基因控制

6、需siRNA介导

7、具有放大效应

四、 RNAi的设计与制备

l 从靶启始密码子下游50-100bp处开始向下游寻找腺嘌呤双核苷酸序列，将此双核苷酸序列和其下游相邻19个核苷酸作为siRNA序列设计模板，5′和3′非编码区和启始密码子附近区域应尽量避免。

l RNAi的G和C碱基含量最好在50%左右，尽量避免GGG的出现，以免影响siRNA的解链，降低RNAi的效应。

l 在EST和NCBI数据库使用Blast程序查找所设计的靶基因是唯一的。

五、RNAi技术应用

l 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于病毒防护、恶性肿瘤的基因治疗、探索基因功能以及传染病和遗传病治疗等领域。

RNAi药物

l 研究人员能够利用这种技术有选择地使某些基因失活。大量公开发表的老鼠试验和实验室研究成果表明，基于RNAi技术的药物有望治疗癌症，病毒性肝炎和艾滋病等疾病，甚至可能用来治疗神经系统疾病，该技术可能产生许多销售额数十亿美元的新药。

l 哈佛大学的遗传学家盖瑞•若昆领导的研究小组发现，利用RNAi技术关闭蠕虫体内的300个基因，其体内脂肪会大大减少，这300个基因中有许多在人体内同样存在。该研究小组推断，可以将这些基因作为药物靶标，开发出能靶向这些基因的传统药物，用以治疗日益严重的肥胖症，这将是一个很大的市场。

RNAi技术的最大难题

l 目前此项新技术研究大都来源于离体细胞实验，在体动物实验则刚刚开始，真正应用于人类疾病的防治尚待时日。

l RNAi技术的最大难题：

l ①药物稳定性问题；

②药物转运载体问题，即如何将药物准确送入特定组织等。