第三节 基因敲除技术（了解即可）

l 基因敲除技术:通过一定的方法使机体内特定的基因失活或缺失的技术。

l 狭义的基因敲除技术主要是通过同源重组方法实现。

基因敲除产生的背景

l 80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。

l 1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。

l   基因敲除一般原理

l 基因敲除(gene knockout)是利用细胞染色体DNA可与外源性DNA同源序列发生同源重组的原理，使特定靶基因失活，以研究该基因的功能。

l 胚胎干细胞（embryo stem，ES）的基因敲除

l 在体外通过基因重组技术构建基因敲除载体，载体中的外源基因与相应的目标基因具有高度的同源性，并对其进行了修饰和改造；

l 将此基因敲除载体通过电穿孔、显微注射等方法导入ES细胞中；

l 外源基因随机整合到ES细胞的基因组中，或与ES细胞基因组中序列相同或相似的目标基因发生同源重组；

l 从中筛选出发生了同源重组的ES细胞，经鉴定和扩增；

l 通过显微注射等方法将ES细胞导入胚胎，再将胚胎植入假孕雌鼠的子宫内发育；

l 产生的小鼠经过交配传代，就可以获得特定的纯合基因型子代小鼠，而用于各类生物学和医学研究。

l 将基因敲除载体转染ES细胞后，大部分的细胞中并没有整合入外源基因，而即使在整合了外源基因的ES细胞中，随机插入的发生概率也远远高于同源重组的概率。因此，从众多的ES细胞中筛选和鉴定出发生了同源重组的ES细胞，是基因敲除中的重要的步骤。

l 目前常用的方法是正负筛选法，标记基因的特异位点表达法以及用于PCR或Southern杂交鉴定。

l ES细胞经体外遗传修饰之后重新引入动物胚胎，可以发育产生嵌合体或完全ES细胞来源的动物。由于同源重组一般只发生于两个等位基因中的一个，获得的动物需要经过进一步交配，以建立纯合型的基因敲除动物模型，进而对其形态、生物学特性等方面进行研究。

l 在得到了杂合型突变动物之后让它们进行互交（intercross），可以产生野生型（25％）、杂合型（50％）和纯合型（25％）的子代，再经过基因型鉴定就可以筛选得到纯合型的基因敲除动物。

l 通过比较正常动物和基因敲除动物在表型上的差异，可以推测被敲除基因的功能。