第二节 目的基因制备技术

为什么需要目的基因制备技术？

1989年批准了第一个在我国生产的基因工程药物—人干扰素α-1b。

一、聚合酶链式反应

l 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外扩增DNA序列的技术，广泛应用于目的基因的制备等几乎所有的分子生物学领域。

l PCR与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个分子生物学技术的基础。

基因工程诞生

l 1973年，Stanford大学的Cohen和Boyer等通过体外重组得到具有双重抗药性重组质粒，实现了细菌间性状的转移 。

l 1973年被定为基因工程诞生的元年。

l Cohen 还因此获得1986年Nobel生理或医学奖。

PCR的发明

l 1973年基因工程诞生掀起核酸研究热潮，但科学家碰到棘手问题！

l 1983年美国Cetus公司的穆里斯（Mullis）周末开车路上灵光突现，发明了PCR。 PCR很快得到生命科学领域最广泛的运用。 Mullis也因此获得1993年度诺贝尔化学奖。

l 1991年12月，霍夫曼罗氏药厂用三亿美元购得Cetus的PCR技术专利。

（一） PCR技术的基本原理（视频演示7）

l 基本原理：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为底物，按照半保留复制的原理，通过变性、退火、延伸三步骤完成新的DNA合成，并反复重复这一过程。

l 两大特点：①灵敏性（ 2n-2n，n表示循环次数），②特异性（由引物控制）。

PCR特异性的数学证明

l 由A，G，C，U任意排成含n个寡核苷酸片段的数目（4n）

l n=1时，41=4种可能（A，G，C，U）；

l n=2时，42=16种可能；

l  (AA, AG, AC, AU；  GG, GU, GC, GU；

l   CC, CA, CG, CU； UU, UA, UC, UG )

l n=3时，43=64种可能（遗传密码）；

l n=n时，4n种可能。

l 附：一般用于PCR的引物大小为15-30个寡核苷酸片段。

（二）PCR体系的基本成分

l ①含有目的基因的DNA模板；

l ②耐热的DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）；

l ③特异RNA引物；（人工合成引物是PCR成功的关键，一对引物分别与欲获得目的基因两条链的3’端序列互补）

l ④4种dNTP；

l ⑤一二价阳离子（如Mg2+、K+）及缓冲液等。

（三）PCR的基本操作
变性-退火-延伸

（1）变性（denaturation）：将待扩增的模板DNA加热到94℃，使双链DNA完全变性解离成为单链DNA；

（2）退火（annealing）：将温度下降至55℃左右，引物与变性的模板DNA利用碱基互补配对结合。退火温度的选择常用于调节PCR产物合成的特异性；

（3）延伸（extension）：将反应体系温度提高到DNA聚合酶作用最适反应温度72℃，DNA聚合酶在合适的缓冲溶液中，以dNTP为底物，严格按照模板链碱基序列合成互补链，即从引物的3端-OH进行延伸，合成方向为5′→3′。

（四）常用的PCR类型
1、巢式PCR

l 巢式PCR（nested PCR）是一种在PCR基础上发展起来的技术。

l 原理是针对同一DNA扩增模板，设计“外侧”和“内侧”两对引物，进行两轮PCR扩增。

l 通过对靶序列两次连续的扩增放大，显著提高了PCR灵敏度和特异性，特别适合微量靶序列的扩增和目的基因的制备。

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2、反转录PCR（RT-PCR）

l 从真核生物成熟的mRNA经反转录得到相应的cDNA，是制备真核生物目的基因的常用方法，并具有灵敏度高、专一性好、简便快捷等优点。

l 它由反转录和PCR两部分组成。

l 第一步反转录，即通过提取组织或细胞中的总RNA，利用oligo(dT)或随机引物，在反转录酶的作用下，将mRNA作为模板反转录成cDNA第一链；

l 第二步是PCR扩增，即以cDNA第一链为模板，用特异性引物进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因转录水平。

补充：实时荧光定量PCR（视频演示8）

l 指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

l 常见有SYBR GreenⅠ法和TaqMan探针法。

SYBR GreenⅠ法

l 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

TaqMan探针法

l 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

PCR的主要运用

l ①PCR在分子生物学上主要用于扩增目的基因。

l ②PCR在医学检验学中主要用于对感染性疾病的诊断。解决了免疫学检测的“窗口期”问题。

l ③PCR在遗传学上能有效的检测基因的突变，用于遗传病诊断。

l ④PCR能准确检测肿瘤相关基因，可进行肿瘤早期诊断和预后判断。

l ⑤PCR还是DNA指纹技术的基础。

二、cDNA文库

l cDNA：以mRNA为模板，经反转录酶催化合成DNA。

l cDNA文库（cDNA library）：指某一生物特定器官或特定发育阶段的细胞内总mRNA，应用逆转录酶生成cDNA，以此构建的重组DNA克隆群称为cDNA文库。

cDNA文库

（一）cDNA文库构建基本原理与方法

l 基本原理：用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者使用随机引物，以提取的总mRNA为模板，进行逆转录PCR，合成的 cDNA连接到适当的载体，转化后获得包含cDNA的克隆群。

cDNA文库构建的基本步骤

l ①提取细胞内总mRNA，经逆转录酶以oligo(dT)为引物合成cDNA第一链；

l ②用RNaseH和大肠杆菌聚合酶I等合成cDNA第二链；

l ③cDNA与接头连接，并经限制酶消化产生粘性末端；

l ④cDNA与末端匹配的载体连接形成重组体；

l ⑤重组体导入宿主细胞，形成重组DNA克隆群。

cDNA文库具有组织细胞特异性

l 基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分（约15%）表达，而且处在不同生理环境（如正常时和疾病时）、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不相同。 所以cDNA文库具有组织细胞特异性。

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（二） cDNA文库目的基因的筛选

l ①根据已知目的基因的核酸序列制备探针，筛选该全长基因的克隆；

l ②当该基因表达产物的少数氨基酸序列已知，可从这些氨基酸序列中推导编码基因的部分序列，合成寡核苷酸探针；

l ③差异显示杂交（differential hybridization）筛选组织特异性cDNA，原理是利用对基因表达存在差异的组织，筛选出其中一种组织中受某种因素调控表达的一种或一组差异基因的方法。

cDNA文库的优越性

l ①cDNA文库具有组织细胞特异性，可用来研究某基因对个体发育的影响。

l ②cDNA文库较小，只有基因组DNA文库1%，筛选比较简单。

l ③cDNA对应的是mRNA,筛选出现假阳性概率低。

l ④cDNA文库是去除了内含子的cDNA构成，可方便分析外显子的基因结构。

三、化学合成

l 随化学合成技术的发展，现在计算机控制的全自动核酸合成仪已被广泛应用，按人们设计好的序列可一次自动合成数十bp长的DNA片段，再组合连接成完整的基因。

l 人工化学合成较长的DNA序列，其价格远高于用PCR法，所以目前很少全部用化学方法去合成基因。但人工设计化学合成核酸片段作为探针、引物、接头(DNA连接子)等已经是分子生物学和基因工程中必不可少的手段。