本章主要内容
l 第一节 分子杂交技术
l 第二节 目的基因制备技术
l 第三节 基因敲除技术(了解即可)
l 第四节 RNA干扰技术
l 第五节 CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术(了解即可)
l 第六节 大分子间的相互作用概述(了解即可)
第一节 分子杂交技术
l 分子杂交技术：利用单链核酸碱基互补配对，抗原与抗体、受体与配体、蛋白与其他分子的相互作用进行目的核酸、蛋白质检测的技术。具有高特异性、高灵敏性、高通量等特点。
核酸杂交定义
l 核酸杂交:单链DNA或RNA分子间只要存在一定程度的序列互补关系，在适合条件下可形成双链或杂化双链的现象。属分子杂交一种。
核酸杂交的运用
l 把一段序列已知的多聚核苷酸用合适的标记物（如同位素、地高辛、生物素等）予以标记，当作探针，与变性后的靶核酸进行杂交。再用合适方法（如放射自显影或显色反应等）把标记物位置检测出来，就可确定靶核酸序列是否存在、拷贝数及表达丰度等重要信息。
核酸探针
l 核酸探针 (probe)：一小段带有标记物的多聚核苷酸，其序列一般已知且与靶核酸分子序列互补。
l 标记物：一般用同位素、地高辛、生物素或荧光染料标记探针的末端或全链。
理想探针标记物的要求
l ①标记前后探针结构和化学性质不变；
l ②特异性强、重复性好；
l ③操作简单、省时；
l ④安全、无污染。
探针标记物
l ①放射性同位素标记物 ：如32P、3H、35S、125I；特点：放射自显影技术检测，信号的强弱通过计数银粒的多少易于进行定量分析。不足是射线对人体有伤害；放射性物质需特殊的处理；半衰期较短不宜长时间存放。现少用。
l ②非放射性标记物：如地高辛、生物素、荧光素。特点：稳定性和分辨率高、检测时间短、操作简便、不需特殊的防护设备、无放射污染。
生物素标记探针的显色反应
l 通过酶促聚合作用将生物素标记的dNTP掺入到DNA中制得探针。
l 抗生物素蛋白有多个位点可以结合生物素，利用抗生物素蛋白和生物素-酶结合去检测这些生物素标记的探针。当其与酶(如AP)的底物反应时，通过反应产物的颜色显示目的基因之所在。
显色反应偶联的酶类
l 显色反应偶联的酶类主要有以下两种：
l ①碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AP) :作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐（BCIP），其可转变为蓝色沉淀物，并释放氢离子将硝基四氮唑蓝（NBT）还原成深紫色沉淀。这些沉淀物都沉积在酶的作用位点。
l ②辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP): 可将3，3’-二氨基联苯胺（DAB）氧化成褐色沉淀或将4-氯萘酚氧化成紫色沉淀物。
l AP灵敏度同32P标记，但后者要在-70℃下曝光几天于X光片上显影，AP发光法只需10～30min。
一、 Southern印迹
l Southern印迹（Southern blotting）是1975年由Edwin Mellor Southern创建的，现已成为进行基因组DNA特异序列定位、检测目标DNA的通用方法。
印迹技术
l 印迹技术：将凝胶中的生物大分子（核酸或蛋白质）转移到固定化介质（如硝酸纤维素膜或尼龙膜等）上并加以检测分析的技术。
l 类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。
琼脂糖凝胶电泳分离DNA或RNA
Southern印迹
l Southern印迹：一种用来检测目标DNA的技术，可检测特定DNA序列（或基因）是否存在以及所在位置。由Southern于1975年首创。
Southern印迹的主要步骤
酶切-电泳分离-变性-转膜-探针杂交
l ①DNA样品经核酸限制性内切酶降解；
l ②琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，凝胶浸泡在NaOH溶液中使DNA变性；
l ③变性DNA转移到固相膜（如尼龙膜）上，固定；并封闭固相膜对DNA探针的非特异性吸附；
l ④DNA探针进行杂交；
l ⑤洗涤除去未杂交的DNA探针，放射自显影或酶反应显色，检测或定位特定的DNA分子。
简约版（视频演示4）
l ①待测DNA样品的制备和酶切；
l ②酶切后DNA样品电泳分离；凝胶中DNA进行碱变性；
l ③变性DNA转移到固相膜上(印迹)；
l ④探针杂交(预杂交、杂交、洗膜)；
l ⑤杂交结果的检测（放射自显影或显色反应）。
二、Northern印迹
l Northern印迹（Northern blotting）：一种用来检测目标RNA的技术。可检测特定基因是否转录以及转录的强弱。
l 其方法类似于Southern印迹，为了与Southern印迹对应，故称为Northern印迹。
Northern印迹一些细节
l 其与Southern印迹方法类似，只是在上样前用甲基氢氧化银或甲醛使RNA变性，不用NaOH变性，因它会水解RNA的2'-羟基基团。
l RNA变性后有利于与NC膜结合，可在高盐中进行转膜，但在烘烤前与膜结合并不牢固，故转膜后用低盐缓冲液洗脱。
l 另外在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与NC膜的结合。可在同一块胶上加分子量已知的标记物一同电泳，之后将该标记物切下、上色、照相，剩余的样品胶则进行Northern印迹。
l 附：标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/mlEB的0.1mol/L醋酸铵中10min，在紫外光下用一次成像拍照。所有操作均应避免RNase的污染。
三、 Western印迹
l Western印迹：一种用来检测的目标蛋白质的技术。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
l 其过程与Southern blotting类似，只不过用带标记的特异性抗体代替核酸探针，故也称为免疫印迹技术（不属于核酸杂交范畴）。
l Western印迹将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移至到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，然后用抗体（一抗和二抗）通过免疫学反应检测目的蛋白，分析基因的表达程度。
Western印迹的主要步骤
电泳分离-转膜-抗体探针杂交
l ①从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离；
l ②把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或PVDF膜）上；
l ③将膜浸泡在蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点；
l ④加入特异抗体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗；
l ⑤通过二抗上标记物的特异性反应进行检测。
Western印迹细节（视频演示5）
l 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
l 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体（一抗）起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗起反应，经过底物显色或电化学发光法（ECL）以检测目的蛋白（定性或定量）。
l 比较典型是一抗用兔源抗体，二抗用羊抗兔抗体且二抗用AP或HRP标志（或化学发光剂）。
NC膜或PVDF膜
电化学发光法（ECL）
l A液：化学发光剂三氯联吡啶钌［Ru（bpy）3］2+络合物
l B液：电子供体三丙胺Tripropylamine,TPA
补充：聚丙烯酰胺凝胶的配制视频演示6
l TEMED(四甲基乙二胺)用于配制PAGE胶等。TEMED可以催化APS(过硫酸铵)从而产生自由基，从而加速聚丙烯酰胺凝胶的聚合。
l PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride)是蛋白质印迹法中常用的一种固相膜。
l
三种印迹技术的比较
四、原位杂交
l 原位杂交：原位杂交是在组织或细胞水平，使用标记探针与细胞内DNA或RNA杂交的方法。
l 将细菌从培养平板转移到NC膜上，然后将NC膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA变性烘干固定于膜上，并与带标记的探针杂交，放射自显影或显色反应检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对比。
原位杂交的主要步骤
转膜-探针杂交
l ①先将平板培养基上菌落或噬菌斑影印在硝酸纤维素膜或尼龙膜上；
l ②将影印后的膜用NaOH溶液处理，裂解微生物，同时使核酸变性而吸附在膜上；
l ③预杂交，以封闭膜对标记探针的非特异性吸附，降低背景噪音；
l ④封闭后的膜与标记探针在缓冲溶液中杂交；
l ⑤洗涤除去未结合的探针；干燥后经放射自显影确定阳性菌落或噬菌斑，再从主平板回收阳性菌落或噬菌斑。
常见分子杂交
l Southern印迹：一种用来检测目标DNA的技术，可检测特定DNA序列（或基因）是否存在以及所在位置。由Southern于1975年首创。
l Northern印迹：一种用来检测目标RNA的技术。可检测特定基因是否转录以及转录的强弱。过程与Southern blotting类似。
l Western印迹：一种用来检测的目标蛋白质的技术。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。过程与Southern blotting类似，只不过用带标记的特异性抗体代替核酸探针，故也称为免疫印迹技术（不属于核酸杂交范畴）。
l 原位杂交：在组织或细胞水平，使用标记探针与细胞内DNA或RNA杂交的方法。
分子杂交的应用
l ①检测特定核酸序列或特定蛋白质在待检样品中的情况；
l ②检测特定基因是否转录和转录的强弱情况；
l ③检测两种核酸分子间的序列相似性；
l ④是基因芯片技术的基础。
五、生物芯片（了解即可）
l 生物芯片（biochip）是将核酸、多肽或蛋白质分子、组织切片和细胞等大量的生物大分子制成探针，以预先设计的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载体上，构成二维分子阵列，然后与待测生物样品靶分子杂交，通过检测杂交信号实现快速、高效、高通量样品检测。
1、基因芯片(gene chip)
l 基于核酸、探针互补杂交技术原理，将大量的寡核苷酸片段按预先设计的排列方式固化在载体表面如硅片或玻片上，并以此为探针，在一定的条件下与样品中待测的靶基因片段或DNA序列杂交。
l 具体内容将在第八章介绍。
2、蛋白质芯片(protein chip)
l 将已知多肽、蛋白质固定于硅片、玻片等支持介质上，制成高密度的多肽分子或蛋白质分子的微阵列，利用抗原与抗体、受体与配体、酶与底物、蛋白质与其它小分子之间的相互作用，检测分析多肽、蛋白质的一项技术。
3、细胞芯片和组织芯片
l 细胞芯片：在芯片上完成对细胞的捕获、固定、平衡、运输、刺激及培养的精确控制，并通过微型化的化学分析方法，实现对细胞样品的高通量、多参数、连续原位信号检测和细胞组分的理化分析。
l 组织芯片：将不同生物体的组织按预先设计或研究需要排列在固相载体上所形成的组织微阵列。
