实验八  病毒鸡胚接种

病毒培养可用动物接种、鸡胚培养和组织培养法。鸡胚接种培养是病毒学的重要方法之一，来自禽类的病毒，均可在鸡胚中繁殖，哺乳动物的病毒如蓝舌病病毒、流感病毒等也可在鸡胚中繁殖。目前鸡胚尤其是SPF鸡胚被广泛利用于分离病毒、制造疫苗和坑原等，其来源丰富，操作简便。除病毒外，衣原体、立克次氏体也可用鸡胚来培养，衣原体可在鸡胚卵黄囊繁殖，致死鸡胚。部分立克次氏体也可在卵黄囊中繁殖。

一、实验目的要求

(1)掌握鸡胚的孵化过程和不同口龄鸡胚的接种途径和接种方法。

  (2)掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔增殖过程。掌握接毒和收毒的方法。

二、实验用品  

  白壳鸡胚、孵化箱、1mL注射器、蛋架、石蜡、酒精棉球、碘酒棉球、青霉素、链霉素、新城疫Ⅰ系和Ⅱ系弱毒苗、生理盐水、隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、干烤箱、天平、等。

三、实验内容及操作程序

 实验准备

    1.鸡胚的选择和孵化  应选健康无病鸡群或5PF鸡群的新鲜受精蛋。为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。用孵卵箱解化，要特别注意温度、湿度和翻蛋。孵化条件一般选择相对湿度为60%，最低温度36℃，一般37.5℃。每日翻蛋最少3次，开始可以将鸡胚横放，在接种前2d立放，大头向上，注意鸡胚位置，如胚胎偏在一边易死亡。

孵化3-4d，可用照蛋器在暗室观察。鸡胚发育正常时，可见清晰的血管及活的鸡胚，血管及其主要分枝均明显，呈鲜红色，鸡胚可以活动。未受精和死胚胚体固定在一端不动，看不到血管或血管消散，应剔除。鸡胚的日龄根据接种途径和接种材料而定，卵黄囊接种，要用5-7日龄的鸡胚;绒毛尿囊腔接种，要用9-10日龄鸡胚;绒毛尿囊膜接种，要用9-13日龄的鸡胚;血管注射，要用12-13日龄鸡胚;羊膜腔和脑内注射，要用10日龄鸡胚。

2.接种前的准备

病毒接种材料的处理怀疑污染细菌的液体材料，加抗生素(青霉素100-500IU和链霉素100-500IU)置室温中1h或冰箱12-24h高速离心取上清液，或经滤器滤过除菌。如为患病动物组织，应剪碎，研磨、离心取上清液，必要时加抗生素处理或滤过。照蛋以铅笔划出气室、胚胎的位置〔图24-1)，若要作卵黄囊才接种或血管注射，还要划出相应的部位。打孔用碘酊在接种处的蛋壳上消毒，并在该处打孔。

[鸡胚的接种]

    鸡胚接种一般用结核菌素注射器注射，注射完后均应用熔化的石蜡将接种孔封闭。

    1.绒毛尿班腔内注射取9-l0日龄鸡胚，用锥子在酒梢灯火焰烧灼消毒后，在气室顶端蛋壳消毒处钻一小孔，针头从小孔处插入，深37.5px.即已穿过蛋外壳膜且距胚胎有半指距离(图24-2)，注射量约0.1-0.2ml,注射后以石蜡封闭小孔，置孵育箱中直立孵育。2.卵黄囊内注射取5-7日龄鸡胚，可从气室顶侧接种(针头插入3-87.5px)，因胚胎及卵黄囊位置已定。也可从侧面钻孔，将针头插入卵黄囊接种。侧面接种不易伤及鸡胚，但针失拔出后部分接种液有时会外溢，需用酒精棉球擦去。

[接种后检查〕

    接种后24h内死亡的鸡胚，系由于接种时鸡胚受损或其他原因而死亡，应该弃去，24h后，每天照蛋2次，如发现鸡胚死亡立即放入冰箱，于一定时间内不能致死的鸡胚亦放入冰箱冻死。死亡的鸡胚置冰箱中1-2h即可取出收取材料并检查鸡胚病变。

四、作业

1.常用鸡胚接种的方法有哪些？

2.鸡胚接种是应该注意哪些事项？