实验七  凝集试验与沉淀

一、实验目的要求

1. 掌握玻片凝集反应和试管凝集反应的原理、操作技术和判定方法。

2. 掌握炭疽环状沉淀试验的原理、操作技术和判定方法。

3. 掌握琼脂扩散试验的操作方法及结果判定。

二、实验用品  

    鸡白痢平板凝集抗原、鸡白痢阳性血清、阴性血清及被检鸡血清、滴管、生理盐水、载玻片、牙签。隔水式恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、炭疽沉淀抗原、炭疽沉淀血清、口径10px小试管、毛细滴管、鸡传染性囊病抗血清、鸡传染性囊病待检抗原、8.5%高渗盐水、优质琼脂、平皿、载玻片。

三、实验方法

（一） 凝集试验

原理：

    细菌、红细胞等颗粒抗原与相应抗体比例适合，有电解质参与下，经过二步特异结合，颗粒抗原被凝集，形成肉眼可见的凝集块。凝集反应中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。凝集试验可用已知的抗原检测血清抗体，也可用已知的免疫血清检查未知抗原，以达到鉴定抗体（抗原）和诊断疾病的目的。

1. 玻片凝集试验：

    1．取清洁玻板一块，用蜡笔划成约75px2的方格，用滴管吸抗原液一滴于方格中心。抗原用前须充分摇匀。

    2．取滴管吸被检血清，滴一滴于抗原液上，随即用牙签（或火柴棒）充分混匀。

    3．于20-35℃环境中，将玻板不断作回旋倾斜摇动，使抗原与血清经常在玻板上旋回流动。3min内观察反应。注意温度过低会影响反应，可将玻板放在用热水或灯泡加温的盒上操作。

    4．每次试验均需作阴性和阳性血清对照。

    5．结果判定：

    (1)如在3min内出现片状或较大颗粒凝集块，液体透明，整个液滴呈花斑状即为阳性反应。记录为“+”。

    (2)如在3min内不出现凝集，玻板上的混合液仍保持原来的状态，或变成中心部分较浓，四周较稀薄的混悬物即为阴性反应。记录为“－。

    (3)对不易判定为阳性或阴性的，可判为疑似反应。记录为“±”。

    观察反应应在3min以内完成。如用无色抗原，观察时玻板下面可衬以黑色背景；如用染色抗原，则用白色背景。

2. 试管凝集试验：

    1．每份血清用4支试管，另取对照管3支，共7支试管置试管架上。

    2．按下表实14-1先加入0.5%石炭酸生理盐水，然后吸取待检血清0.2m1，加入第1管中，吹吸混合3次后弃去1.5ml，再吸0.5m1于第2管中，如前法依次稀释至第4管，混合后弃去0.5ml。第5管不加血清为抗原对照，第6管加1：12.5的阳性血清，第7管加1：12.5阴性血清各0.5m1。

    3．每管均加入用0.5%石炭酸生理盐水稀释的布氏杆菌试管凝集抗原0.5m1。抗原的稀释按瓶签说明，通常1：10稀释。

    4．加毕后，充分振摇混合，置37℃温箱4-10h，取出后置室温18-24h,观察结果。 

    5．结果判定：

    十十十十  液体完全透明，菌体完全凝集于管底呈伞状，振摇时沉淀物呈片状、块状或颗粒状（100%菌体凝集）。

    十十十  液体略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振摇后情况同上（75%菌体凝集）。

    十十  液体不甚透明，管底有明显的凝集，振摇时有块状或小片絮状物（50%菌体凝集）。

   十液体透明度不明显或不透明，有少量颗粒凝集（25%菌体凝集）。

   －液体不透明，管底无凝集，有时管底中心可能有少量抗原沉淀，但振摇后立即散开呈均匀混浊。

    确定血清凝集价时，应按出现“十十”凝集现象的最高血清稀释度为该血清的凝集价。

判定标准

    牛、马和骆驼凝集价1：100以上，猪、山羊、绵羊和狗凝集价1：50以上为布氏杆菌感染阳性。牛、马和骆驼1：50，猪、羊等1：25为可疑。

（二） 沉淀试验 

1．炭疽环状沉淀试验

抗原处理：如待检样为皮张可用冷浸法：检样置37℃温箱烘干，高压灭菌后，剪成小块称重，然后加入5～10倍的石炭酸生理盐水，放室温浸泡10～24h，用滤纸过滤2～3次，使之呈清朗的液体，此即为待检抗原。

加样：取3支口径0.100px的小试管，在其底部各加约0.1mL的炭疽沉淀血清(用毛细血管加，注意管壁可有气泡)。取其1支，用毛细管将待检抗原沿着管壁重叠在炭疽沉淀血清之上，上下两液间有整齐的界面，注意勿产生气泡。另2支小试管，一支加炭疽阳性抗原，另一支加生理盐水，作为对照。

结果判定：5～10min内判定结果，上下重叠两液界面上出现乳白色环者，为炭疽阳性。对照组中，加炭疽阳性抗原者应出现白环，而加生理盐水者应不出现白环。

2．小鹅瘟抗血清琼扩效价滴定

琼脂板制备：称取1g琼脂粉，加至100mL 8.5%的高渗盐水中，煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至55℃左右时浇玻板，厚约2mm。

打孔：在琼脂凝胶上打梅花孔，孔径为2mm，中间孔和周围孔间的距离大约为3mm。

稀释与加样：将小鹅瘟高免血清作2倍比稀释，即1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32等，分别加至周围孔中，中间加小鹅瘟琼扩抗原。

作用：将琼脂凝胶板放置湿盒中，在饱和湿度下，于37℃扩散24h。

结果观察：抗原抗体在凝胶内扩散，在两孔之间比例最适合的位置出现沉淀带，出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即抗体效价。

 

四、作业

1．琼脂扩散试验常用于复杂抗原的分析，为什么?

2．哪些因素影响细菌凝集试验?凝集试验中为什么要设生理盐水对照?