实验五 细菌的生化试验

                        

一、实验目的要求

了解各种常用的细菌生化试验原理、方法和结果判断。

二、实验用品  

隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、天平、接种环、酒精灯、试管、营养琼脂、甲萘粉、浓盐酸、95%酒精、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甲基红、氢氧化钾、对二甲氨基苯甲醛、精密pH试纸、试管架、二甲苯、火柴。

三、实验方法及步骤

基本原理

    不同种类的细菌产生的酶类活性不同，因此，在代谢过程中产生分解产物和合成产物各不相同。细菌学检验工作中利用细菌生化特性，以生物化学方法来鉴别细菌，称为生化试验。此类试验，特别是细菌分解各种碳水化合物、蛋白质、氨基酸以及生物氧化（呼吸）的酶和产物的测定，在细菌的鉴定中极为重要，方法也很多，以下介绍一些基本的生化试验方法。近年来出现的各类细菌快速微量系列生化检验的方法，都是在这些基本方法的基础上发展起来的。各项生化试验的具体原理分别见各试验。

常用生化试验

    （一）糖发酵试验

    1.原理  各种细菌具有的酶不同，有的细菌能分解某些糖类而产酸产气，有的细菌虽能分解某种糖类，但只产酸不产气，有的细菌则不能分解。借此特点，可以鉴别细菌。

    2.方法  将需要鉴别的细菌纯培养物，分别接种在各种含指示剂的糖发酵管内，将发酵管倒置于37℃温箱中培养，培养的时间随试验的要求及细菌分解能力而定，可按各类细菌鉴定方法所规定的时间进行。

    常用的单糖发酵管主要有葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、木糖及半乳糖等；双糖主要有乳糖、麦芽糖、蔗糖及蕈糖等；多糖发酵管主要有菊糖、肝糖、糊精、淀粉等；醇类发酵管主要有甘露醇、卫矛醇、山梨醇、侧金盏花醇（福寿草醇）、肌醇、甘油等。糖甙发酵管主要有水杨甙、七叶甙、松柏苷等。

    3.结果  产酸产气时，可使培养基的指示剂变色，并可在发酵管内顶端出现气泡；只产酸时仅见发酵管内培养基颜色改变，不见气泡；不分解者无反应。如大肠杆菌分解乳糖产酸产气；用“⊕”表示，金黄色葡萄球菌虽能分解乳糖，但产酸不产气，用“+”表示；马流产沙门氏杆菌不能分解乳糖，用 “＿”表示。

    （二）伏—普（Voges-proskauer）氏试验（简称V-P试验）

    1.原理  某些细菌（如产气杆菌、阴沟杆菌等），能分解葡萄糖产生丙酮酸，再进一步将丙酮酸脱羧，变为乙酰甲基甲醇。加KOH溶液后，在碱性环境下，乙酰甲基甲醇被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的肌基发生反应，生成红色的化合物。在培养基中加入少量含胍基的化合物（如肌酸或肌配等），可以加速这个反应。在加KOH前，先加入α-萘酚，也可提高试验的敏感性。

    2．试剂

    甲液  50g/L     α-萘酚无水乙醇溶液（含3g/L肌酸）  

  乙液  400g/L    氢氧化钾溶液

    3.方法  将被检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养管中，经37℃培养48h。加入甲液、乙液各一滴，充分摇动培养管，观察结果。

    4.结果  如立即或于数分钟内出现橙红色或红色反应者为阳性。不变色者，将培养管放37℃中4h后再进行观察，若仍不变色或仅呈淡褐色者为阴性。产气杆菌为阳性，大肠杆菌为阴性。

    （三）甲基红试验（MR试验）

    1.原理  某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸、丙酮酸再被分解，则可产生甲酸、乙酸、琥珀酸、乳酸等，这样使培养基的pH降至4.5以下，这时加入甲基红指示剂呈红色。甲基红指示剂变色范围为pH4.4（红色）-6.2（黄色）。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醛、气体和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色为阴性。

    2.试剂  甲基红0.02g,溶于60ml  95 %乙醇中，加蒸馏水至l00ml。

    3.方法  将细菌接种在葡萄糖蛋白陈水中，在37℃培养3-4d，加入MR试剂1-2滴，观察反应结果。

    4.结果红色反应为阳性，无色反应为阴性。例如，大肠杆菌为阳性，产气杆菌为阴性。

    （四）石蕊牛乳试验

    1.原理  牛乳中含有大量的乳糖和酪蛋白，营养丰富，一般细菌均可在其中生长。但各种细菌对这些物质的分解能力不同，可观察的反应也不同。有的细菌如产气荚膜杆菌，对牛乳具有强烈发酵反应，产酸、产气、凝固、胨化几乎同时发生，所产生的气体，可将培养基表层的凡士林冲至管口，牛乳可全被胨化变清，这种现象被称为“汹涌发酵”，为该菌所特有。有的细菌不发酵乳糖，而分解含氮物质，生成氨及胺，使培养基变为碱性，石蕊指示剂变为蓝紫色。

    2.方法  将被检细菌接种于石蕊牛乳培养基中，置37℃温箱中培养1-7d。

    3.结果  出现“汹涌发酵”，牛乳胨化变清，为产气荚膜杆菌。无变化或出现蓝紫色为其他细菌。

    （五）靛基质（indol吲哚）形成试验

    1.原理  某些细菌（如大肠杆菌、变形杆菌等）能够分解培养基内蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质，若再与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用后，形成玫瑰红色靛基质。

    2.试剂  对二甲基氨基苯甲醛1g，95%酒精95m1，浓盐酸50m1。

    首先将对二甲基氨基苯甲醛溶于酒精中（也可用丁醇或戊醇），然后再徐徐加入浓盐酸即成。

    3.方法  将被检细菌接种于胰蛋白胨水中，于37℃培养2-3d，沿试管壁滴加上述试剂于培养基液面上，即可观察。

4.结果  在培养物与试剂的接触处出现玫瑰红色为阳性反应；无红色，仍为淡黄色为阴性。例如，大肠杆菌为阳性，沙门氏菌为阴性。

四、作 业

1.观察记录糖发酵试验结果。

2.观察记录吲哚形成试验试验、甲基红试验及VP试验结果。