实验四 细菌的分离培养及培养性状观察
一、实验目的要求
1．掌握需氧菌分离培养的基本要领。
2．了解厌氧菌的分离培养原则及常用的几种分离培养法。
3．了解细菌在固体和液体培养基中的生长表现。
二、实验用品
隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、天平、接种环、酒精灯、试管、营养琼脂、平皿、精密pH试纸、试管架、火柴。
三、实验方法及步骤
细菌分离培养和移植的一般原则
分离培养是细菌学检验的基本技术之一。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养的步骤：先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。进行细菌分离培养和移植应注意下列事项：
1．选择适当培养基和培养条件。分离培养前应充分考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长的培养基以及所需的气体与培养温度（病原菌一般为37℃）等。
2．严格无菌操作、防止污染。培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰，接种环必须经火焰彻底灭菌；操作完毕后，防止再让培养基接触外界空气，接种环通过酒精灯火焰灭菌。
3．防止过热的接种环杀死需要分离培养的细菌。接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细菌材料，否则会将细菌烫死；另外，还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。
4．纯化分离菌。初代分离时若长出两种以上菌落，应进一步挑选可疑菌落进行纯培养。
细菌的分离培养法
（一）需氧菌分离培养法
1．平板划线法 此法为最常用的细菌分离培养方法，其原则在于使被检材料充分分散，以便经过培养后得到单个菌落，并可对菌落的形态、颜色、溶血与否等进行观察。
术式：右手似持毛笔的姿势持接种棒的塑料柄处，将接种环伸入酒精灯火焰中烧至通红，再缓慢将接种棒其余金属部分均加以烧灼，准备蘸取材料；左手取琼脂平板，琼脂面与水平面成45°角，接种环同培养基平面也成45°角。靠近酒精灯火焰操作。
方法：接种环经烧灼灭菌、冷却后，蘸取欲分离材料少许，按图实5-2中所示的几种划线方式，选择其中一种进行划线。注意不要划破琼脂，不要划得太疏，不要过多重复划线，以免形成菌苔。划毕，将培养基用皿盖盖好，接种环烧灼灭菌，于皿底用蜡笔标记被分离材料名称及日期，倒转置37℃恒温箱中培养。
2．倾注法 取3支预先准备的普通琼脂培养基管，水浴加热融化，冷至约50℃，用火焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第1管内，充分摇匀后，自第1管取一接种环内容物至第2管，以同样方法自第2管移种至第3管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置温箱内培养。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落．仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。此法目前已较少应用。
（二）厌氧菌分离培养法 厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在，故在培养厌氧菌时，必须创造一个厌氧环境，一般以降低氧的张力或保持减低的氧张力为原则。目前，应用于厌氧菌的分离培养方法颇多，现就其中较简便的几种方法介绍如下：
1.焦性没食子酸法 利用焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧的原理进行厌氧培养。通常2500px3空间用焦性没食子酸1g，10%氢氧化钠或氢氧化钾l0ml。具体方法有下列几种：
(1)平板培养法将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板。取一小团直径约50px的脱脂棉，置于平皿盖的内面中央，其上滴加10%氢氧化钠溶液约5ml；在靠近脱脂棉的一侧放置焦性没食子酸约0.5g,注意暂勿使两者接触。立即将已接种的平板覆盖于平皿盖上，迅速用融化的石蜡密封平皿边缘周围。封毕，轻轻摇动平皿，使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子酸接触，然后置37℃恒温箱中培养。
(2)干燥器培养法 于干燥器底部放入氢氧化钠溶液适量，然后再放入2-3个略高于液面的玻璃圆柱（可利用链霉素小瓶），将适量焦性没食子酸用纸或纱布包好，放置于圆柱上面使暂勿与氢氧化钠接触。然后放下隔板，将已接种的培养皿或试管置于隔板上，待一切准备好后，将盖盖好密封，并轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中。
2．高层琼脂柱摇震培养分离法
(1)取长约15 cm的玻璃管一支，一端塞以小胶塞或小木塞，另一端塞以棉花塞，高压灭菌备用。
(2)加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基，待冷至50℃左右，接入少许经适当稀释的待分离的培养物或含菌材料，充分摇震均匀。
(3)在琼脂凝固前，迅速以无菌滴管吸取上述已接种的琼脂培养基，注入上述（1）准备好的玻璃管内，装至4/5左右之处，塞好棉花塞，放在大试管或玻璃筒内，置37℃恒温箱中培养。
(4)长出菌落后，拔去胶塞和棉花塞，以无菌玻棒将琼脂柱推出于无菌平皿中，再用灭菌接种环钓取独立菌落作厌氧纯培养。
3．连二亚硫酸钠法 将已接种的平板或斜面培养基，置于一玻璃干燥器内（预先测出体积），按每1000rnI容积称取连二亚硫酸钠（又称保险粉）和无水碳酸钠各4g，并分别研细均匀，临用前混合置于一平皿内，放在培养基上层，然后将盖盖严，用凡士林密封，置37℃恒温箱中培养。
（三）二氧化碳培养法 少数细菌如布氏菌（牛型），在含有10%二氧化碳环境下生长良好。若没有二氧化碳培养箱，可采用一直应用的烛缸法（图实5-3）：将接种的培养基置玻璃干燥器或其他可以密闭的玻璃缸内，于其内点燃一小段蜡烛，加上盖（盖边涂上凡士林以防漏气），约l min左右蜡烛熄灭，此时缸内氧气已被消耗，缸内所含二氧化碳约10%。注意蜡烛勿太长，而且不宜靠近缸壁，以免因局部玻璃过热而破裂。
自患病动物病料中分离病原菌方法
所需器材：酒精灯、酒精棉、刀、剪、镊等，要求无菌操作。
1.琼脂斜面分离法 取琼脂斜面3管，用接种环蘸取欲检病料少许（如为脏器，先将表面烧烙后，用灭菌解剖刀切开，以灭菌接种环由切口插入、转动、钓取组织），混合于第1管的凝集水中，再作斜面划线；然后抽出接种环，不经烧灼，继续在第2管、第3管斜面上作同样划线。划毕，置37℃温箱中培养。经此法分离培养后，第2管的菌落较第1管为少，第3管的菌落更少，如此较易得到单个菌落，达到纯粹培养之目的。
2.琼脂平板涂布分离法 被检病料如血液、腹水等，可用灭菌毛细吸管或吸管吸取，置1-2滴于平板中央，用灭菌的L形玻棒作均匀涂布。如估计细菌数很多，可直接用火焰灭菌的铂金耳钓菌，并做分区划线。如为脏器病料，可先作成乳剂再行涂布；或取其一小块，用镊子夹住，表面烧烙后，用灭菌刀切开，以其切面直接进行涂布，此法适用于含菌量较少的病料的分离。
3.营养肉汤分离法 当组织病料中含病原菌少，或有抗菌药残留时，用上述琼脂斜面或平板分离法可能无菌落长出，这时可以无菌操作剪取一小粒病料直接投人肉汤，经37℃培养，在肉汤中长出细菌后，再用琼脂斜面或琼脂平板分离。
4.试验动物分离法 被检病料中疑有某种病原菌存在，可将病料以无菌操作取出，放入灭菌乳钵或组织匀浆器内，加3-5倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量注射（肌肉、腹腔、皮下或静脉）入易感实验动物，待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。例如，疑有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后，再取其脾脏以分离猪丹毒杆菌，常可得到纯培养。
钓菌纯培养
被检材料经分离培养后，选择一个可疑菌落，用灭菌接种环（针）钓取少许，接种在新的培养基上，称为钓菌。钓取一个菌落培养出来的细菌培养物，称为纯培养物。纯培养的目的在于对分离出的病原菌进一步进行鉴定和其他试验研究。
（一）需氧菌的纯培养方法
首先用肉眼或放大镜观察并选择可疑的单个菌落，然后以蜡笔在可疑菌落下面的平皿底上作一记号，用灭菌的接种环（针）轻轻接触菌落，蘸取菌料少许，作抹片、染色、镜检。若其染色和形态与怀疑的致病菌一致，即接种于适当的培养基，置37℃恒温箱中培养。
（二）厌氧菌常用的培养基和纯培养方法
1.熟肉培养基接种法 熟肉培养基适用于第一代增菌培养。
原理：利用培养基中的熟肉有不饱和脂肪酸和戴氨酸能吸收培养基的氧，使氧化还原电势下降，造成厌氧环境。
方法：接种前先将培养基加热至沸，并立即于流水中使之迅速冷却，以除去溶于液体中的气体。接种后，加入灭菌液体石蜡少许，以隔绝空气并防其进入，效果更佳。
2.高层琼脂穿刺接种法 加热溶化葡萄糖高层琼脂，置流水中使之迅速冷却、凝固，以排除内部空气。然后穿刺接种厌氧菌，并用烧灼接种环融封穿刺孔，置3790温箱中培养。
3．试管厌氧培养法（Buchner氏试管法） 取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g及玻璃珠数个，将已接种的试管置大试管中，加入20%氢氧化钠，迅速塞封管口，置37℃温箱中培养。
细菌移植方法
1.接种环移植法 按图实5-4，以左手拇指与食指持一支菌种试管，食指与中指持一支待接种的琼脂斜面试管，斜面均向上，管口并齐，管底握于掌中；以右手执接种环，并进行火焰灭菌；以右手的中指和无名指扭开并夹住第一管的棉塞，无名指和小指扭开并夹住第二管的棉塞，或以小指同时扭开并夹住两管的棉塞；将管口通过火焰灭菌；然后用烧灼灭菌后冷却的接种环伸入菌种管琼脂斜面上取少许菌，可按图实5-5中的一种方式接种于无菌的琼脂斜面上；同样将管口通过火焰灭菌，塞好棉塞，最后将接种环烧灼灭菌，用蜡笔在试管上标记菌名、日期，置37℃温箱中培养。厌氧菌移植的常用培养基和培养方法如三、（二）项。
2.吸管或注射器移植法 欲移植定量的液体培养物或表面有液体石蜡油的厌氧菌培养物，也可以利用吸管或注射器移植，其操作方法系以无菌吸管或无菌注射器吸取培养物，代替接种环进行移植。
四、作 业
1.试述细菌分离培养的目的。
2.观察记录实验结果。
