实验三  培养基的制备

一、实验目的要求

    1．了解一般培养基的种类与用途，及制备培养基的基本原理。

2．学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。

二、实验用品  

隔水式恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、电磁炉、天平、试管、平皿、pH试纸、称量纸、蛋白胨、氯化钠、牛肉浸膏、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、磷酸氢二钾、氢氧化钾、蒸馏水等。

三、实验方法

1、称量：按培养基的配方，计算所需原料的准确数量，称取各种物质。

 2、配调：将称量好的物质按照一定的顺序放入定量水中，加热溶解，完全溶解后补足所失水分。

 3、调PH值：一般中1mol/L的NaOH或1mol/L的HCL调节培养基的PH值达到要求范围。PH测定可用PH试纸，比色管或PH计。

 4、加指示剂：按要求加入一定量指示剂。

 5、过滤：用滤纸或2~4层的纱布过滤，固体培养基须趁热用纱布过滤。

 6、分装：将过滤后的培养基分装于容器内。A、三角烧瓶：不超过1/2; B、试管：液体、高层、半固体培养基约装试管容量的1/4~1/3，斜面培养基约装1/5。

 7、加塞：分装后，在试管口或烧瓶口加塞，防止由此引起的污染。

 8、包扎：加塞后，将试管扎成捆，包牛皮纸，用绳扎好。防止灭菌时冷凝水沾湿或灭菌后灰尘侵入。

 9、灭菌：最常用的是高压蒸汽灭菌法，培养基灭菌的温度和时间，按照各培养基的规定进行。

 10、鉴定：将消毒冷却后的培养基置于37℃恒温箱中24小时后，观察有无杂菌生长。若有杂菌生长则弃去；若无杂菌则接入微生物菌种培养观察。

 11、保存：经验定合格的培养基，应避免干燥、氧化、PH值的改变和杂菌的污染，于暗处保存。

四、培养基种类及配方

1、普通营养琼脂：

成分：

蛋白胨　　　　1g

牛肉膏　　　　0.5g

氯化钠　　　　0.5g

琼脂　　　　　2g

蒸馏水　　    100mL

制法：将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入1%氢氧化钾溶液，校正pH至7.2～7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装烧瓶，121℃高压灭菌20min。

注：此培养基可供一般细菌培养之用，倾注平板或制成斜面。

2、糖发酵管培养基：

成分：

　蛋白胨　　　　　  1g

　氯化钠　　　　　　  0.5g

所需糖种类        1g

琼脂                0.5g

1.6%溴甲酚紫酒精溶液　0.1mL

　蒸馏水　　　　　　100mL

制法：

选取所需糖的种类，葡萄糖、乳糖、麦芽糖分别做三种糖发酵管。除1.6%溴甲酚紫酒精溶液不加入之外，上述其余成分配好后，加热溶解，然后调节平pH至7.4，最后加入1.6%溴甲酚紫酒精溶液，然后分装到小试管中，加上棉塞，用报纸包扎好，115℃高压灭菌20min。　

试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物穿刺接种，于37℃培养，一般观察2～3d。

3、蛋白胨水：

成分：

蛋白胨             1g

氯化钠　　　　　　　 0.5g

蒸馏水　　　　　　　 100mL

制法：　按上述成分溶解后，调节pH至7.4，分装小试管，121℃高压灭菌20min。

靛基质试剂

柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸25mL。

欧－波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。

试验方法：挑取小量培养物接种，在36±1℃培养1～2d，必要时可培养4～5d。加入柯凡克试剂约0.5mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧－波试剂约0.5mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。

注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。　　

4、葡萄糖蛋白胨水：

成分：

磷酸氢二钾　　  1g

蛋白胨　　　　　1g

葡萄糖　　　　　1g

蒸馏水　　　　　200mL

制法：加热溶解后校正pH至7.4，分装试管，115℃高压灭菌20min。

甲基红(MR)试验：自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中，于37℃培养2～5d。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。

甲基红试剂配法：10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸馏水。

V－P试验：用琼脂培养物接种培养基中，于37℃培养2～4d。加入6%α萘酚乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在37℃下培养4h再进行观察。

五、作 业

试述培养基制备的注意事项。