实验二  细菌抹片的制备及染色

 

一、实验目的要求

1．掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏方法。

2．认识细菌革兰氏染色反应特性。

二、实验用品  

隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、天平、接种环、酒精灯、试管、营养琼脂、95%酒精、草酸铵结晶紫染色液、革兰氏碘溶液、碱性复红液、玻片、纱布、染色缸、洗瓶、吸水纸、试管架、二甲苯、擦镜纸、香柏油、火柴。

三、实验方法及步骤

1、玻片准备  新玻片或用后的玻片，应按附录一中（二）的方法处理后才用。用过很多次，表面已有许多划痕的玻片应废弃。

 手持玻片时，应以拇指、食指或中指夹住载玻片上下两边缘，以免表面粘上手印。载玻片应清晰透明而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，用玻璃铅笔容易画上记号。如有残余油渍，可滴上95%酒精2-3滴，用清洁纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻通过几次。若仍未能除去油渍，可再滴上1-2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。

2、抹片  材料不同，抹片方法有差异。

    液体材料如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。

    固体材料如菌落、脓粒、粪便等，则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层（不宜太厚）。

    组织脏器材料：先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀剪取一小块，夹出后以其新鲜切面在玻片上压印或涂抹成一薄层。

    如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，可以在同一张玻片上，先用蜡笔在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。需要保留的标本，应先做好标记，待标本染色后贴上标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。

3、干燥  上述涂好的抹片，应让其自然干燥或在酒精灯火焰上拖过以适当加温（以不烫手为度），促其干燥。

4、固定  固定方法有2种：

    ⑴.火焰固定  将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上以钟摆的速度来回通过3-5次，略作加热（但不能太热或烧灼，以手背能忍受为度），进行固定。

    ⑵.化学固定  血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色(Giemsa stain)时，不用火焰固定而用甲醇固定。可将已干燥的抹片浸入甲醇中2-3 min，取出沥干；或者在抹片上滴加数滴甲醇，使其作用2-3 min后，自然挥发干燥或沥干；抹片如作瑞氏染色（Wright’s stain)，则不必先作上述固定，因染色液中含有甲醇，可以达到固定的目的。

    抹片固定的目的在于：

    ①使抹片除去水分，很好地贴附在玻片上，以免被水洗时冲掉。

    ②使抹片易于着色或更好地着色，因为死菌比活菌着色力强。

    ③可能杀死抹片中的微生物。

 必须注意：在抹片固定过程中，实际上并不保证能杀死全部细菌，也不能完全避免在染色水洗时会将部分材料冲脱，因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的染色抹片时，应严格慎重处理染色用过的残液和抹片本身，以免引起病原的散播。固定好的抹片，即可进行各种方法的染色。

㈡、染色——简单染色法  

只用一种染料进行染色的方法，如美蓝染色法。

美蓝染色法：在已干燥、固定好的抹片上，滴加适量的（足够覆盖抹片点即可）美蓝染色液，经1-2 min，水洗，沥去多余的水分，用滤纸吸干或火焰上来回烘干（不能太热），镜检。

㈡、染色——革兰（Gram）氏染色法

    ⑴在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1-2min，水洗。这时细菌都染成紫色。

    ⑵加革兰氏碘溶液于抹片上助染，作用1-3 min，水洗。这时细菌都呈更深的紫色。

    ⑶加95%酒精于抹片上脱色，约30s至1 min,水洗。这时有的细菌紫色被脱去，呈无色；有的紫色脱不了，仍保持紫色。

    ⑷加碱性复红液复染10-30 s，水洗。这时已脱色的细菌复染成红色，未脱色的细菌呈蓝紫色。

    ⑸吸干或烘干，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

四、作 业

试述革兰氏染色的关键步骤。